EIN<em> Caenorhabditis elegans</em> Nährwert-basierter Kupfer-Aversion-Assay
Summary
Hier präsentieren wir einen Caenorhabditis-Elegans- spezifischen Assay, der dazu bestimmt ist, Veränderungen des Kupfer-Aversionsverhaltens und die Fähigkeit, eine gemeinsame Nahrungsquelle zu lokalisieren, zu bewerten, da der Organismus von einem gut gefütterten bis hin zu verhungertem Ernährungszustand fortschreitet.
Abstract
Um das Überleben zu sichern, müssen die Organismen in der Lage sein, ungünstige Lebensräume zu vermeiden und gleichzeitig eine gleichbleibende Nahrungsquelle zu gewährleisten. Caenorhabditis elegans verändern ihre Lokomotionsmuster bei der Erkennung diverser Umwelteinflüsse und können ihre Abhängigkeit von Verhaltensreaktionen als Reaktion auf Hungerbedingungen modulieren. Nematoden zeigen typischerweise eine verringerte aversive Antwort, wenn sie aus einer Nahrungsmittelquelle für mehr als 30 min entfernt werden. Die Beobachtung von Verhaltensänderungen in Reaktion auf einen sich ändernden Ernährungsstatus kann Einblick in die Mechanismen geben, die den Übergang von einem gut gefütterten in den verhungerten Zustand regeln.
Wir haben einen Assay entwickelt, der die Fähigkeit eines Nematoden misst, eine aversive Barriere ( dh Kupfer) zu überqueren und dann über einen längeren Zeitraum eine Nahrungsquelle zu erreichen. Dieses Protokoll baut auf früheren Arbeiten auf, indem es mehrere Variablen in einer Weise integriert, die eine fortlaufende Datenerfassung ermöglicht, während sich die Organismen zu einemN zunehmend verhungert. Darüber hinaus erlaubt dieser Assay eine erhöhte Probengröße, so dass größere Populationen von Nematoden gleichzeitig ausgewertet werden können.
Organismen, die für die Fähigkeit, Kupfer zu erkennen oder zu reagieren, sofort die chemische Barriere kreuzen, während Wildtyp-Nematoden anfänglich abgestoßen werden. Da Wildtyp-Würmer zunehmend verhungert sind, beginnen sie, die Barriere zu überqueren und die Nahrungsquelle zu erreichen. Wir haben diesen Assay entworfen, um eine Mutante zu bewerten, die nicht in der Lage ist, auf verschiedene Umwelt-Cues zu reagieren, einschließlich der Nahrungsmittelempfindung oder des Nachweises von aversiven Chemikalien. Wenn sie über dieses Protokoll ausgewertet wurden, überquerten die defekten Organismen sofort die Barriere, waren aber auch nicht in der Lage, eine Nahrungsmittelquelle zu detektieren. Daher kreuzen diese Mutanten wiederholt die chemische Barriere, obwohl sie vorübergehend eine Nahrungsquelle erreichen. Dieser Assay kann einfach die Populationen von Würmern testen, um mögliche Wegdefekte im Zusammenhang mit Abneigung und Hunger zu bewerten.
Introduction
Caenorhabditis elegans wurde als Modell für das Studium der Neurobiologie seit Jahrzehnten aufgrund der relativen Leichtigkeit bei der Analyse der Schaltungen eines Nervensystems aus nur 302 Neuronen 1 verwendet . Vorausgesetzt, dass der Organismus auf die Reaktion auf Umwelt-Cues angewiesen ist, ist ein Großteil des Nervensystems der Regulierung der Integration von Umweltsignalen gewidmet 2 . Trotz der Einfachheit seines Nervensystems kann C. elegans verschiedene Umweltsignale erkennen und darauf reagieren, einschließlich Repellents 3 , Lockstoffe 4 , Temperatur 5 und sogar Feuchtigkeit 6 . Ein nicht ordnungsgemäß Umweltsignale integrieren hat zu einer Reihe von Verhaltensstörungen und neurodegenerativen Erkrankungen in Säugern Modellsystemen 7- 9 verbunden. Mit einer Reihe von verfügbaren neuralen Krankheit Modelle 10 de C. elegans und die Entwicklung von Nematoden-Pharma-Bildschirmen 11 hat sich dieser Organismus als ein nützliches System für das Studium der Neurobiologie erwiesen. Angesichts der Verfügbarkeit eines abgebildeten Nematoden-Verbundes 1 und Mutationen für fast jedes Gen im Nematoden-Genom 12 ist unser Verständnis des Nematoden-Nervensystems und durch die Erweiterung unserer eigenen teilweise durch die Gestaltung von kreativ geeigneten Assays begrenzt.
Eine Reihe von Chemotaxis-Assays wurden in den letzten 40 Jahren entwickelt, um die Nematoden-Ansprechempfindlichkeit auf verschiedene aversive Stimuli 3 , 4 , 13 , 14 , 15 zu bewerten. Initiale Experimente waren die Einführung eines akuten Umwelteinflusses, während ein einziger Wurm auf einer Agarplatte durchstreifte= "Xref"> 3 , 14 , 16 . Sofortige Änderungen der Lokomotionsreaktionen wurden aufgezeichnet. Zum Beispiel kann der flüchtige Geruchsstoff Octanol auf ein Haar aufgetragen werden und vor einem Nematoden der Nase geweht 17 die Einleitung rückwärts Fortbewegung in Wildtyp – Würmern zu stimulieren. Komplexere Assays wurden auch entwickelt, um mehrere Variablen als Mittel zur Bewertung der Verhaltensauswahl zu integrieren 18 . Eine Variation dieses Assays beinhaltet die Verwendung einer Kupferlösung, um eine aversive Mittellinienbarriere 4 zu erzeugen. Ein Lockmittel, nämlich Diacetyl, wurde auf einer Seite der chemischen Barriere mit Würmern, die von der Diacetylquelle weg übertragen wurden, platziert. Würmer defekt für Kupfer aversive Reaktionen sofort über die Barriere, um das Diacetyl zu erreichen, während Wildtyp-Würmer wurden zunächst von der Barriere abgelehnt. Responses wurden erzielt, als Würmer zuerst die Kupferbarriere nähertenOhne langfristige Beobachtungen.
Wenn Würmer ausgewertet werden nach Hungerbedingungen unterzogen, ihre Empfindlichkeit auf Umweltreize 19 verringert. Wenn das aversive chemische Octanol vor der Nematoden-Nase geweht wird, stimulieren Wildtyp-Organismen die Rückwärtsbewegung innerhalb von 3 – 5 s, wenn sie auf Nahrung sind. Nachdem diese Organismen 10 Minuten aus der Nahrung entfernt worden sind, zeigen sie eine verzögerte Reaktion von 8 – 10 s 20 . So zeigen Nematoden mit erhöhtem Hunger eine verminderte aversive Reaktion auf schädliche Umweltsignale, da die Suche nach Nahrung für das Überleben wesentlich wird. Umgekehrt reagieren Nematoden, die den Neuropeptidrezeptor 9 ( npr-9) überexprimieren , nicht auf Octanol auf oder aus der Nahrung und zeigen eine Unfähigkeit, auf eine Anzahl von aversiven Reizen zu reagieren 21 . Diese npr-9 (GF) -Organismen modulieren auch nicht ihre Umkehrfrequenz in Gegenwart von Nahrung, sondern könnenUmgekehrt als Reaktion auf harte Berührungsstimulationen, die darauf hinweisen, dass sie in der Lage sind, Rückwärts-Fortbewegung 21 zu machen . Wir haben auch npr-9 (LF) -Mutanten ausgewertet, da sie eine ungewöhnlich verminderte Umkehrfrequenz aus der Nahrung aufweisen und dennoch ihr Verhalten in Gegenwart von Nahrung modulieren können 21 . Die Kopplung des Ernährungszustandes des Wurms mit der Einführung akuter externer Reize hat bei der Aufklärung der Mechanismen unterstützt, mit denen ein lebensmittelbezogener Weg die sensorischen Signalwege 22 , 23 weitgehend modulieren kann. Die Anwesenheit von Speisen in der Nematodenumgebung wurde auch verwendet, um Ethanol-Entzugsantworten zu bewerten 24 . In diesem Experiment wurden die Würmer in unterschiedlichen Konzentrationen von Ethanol inkubiert und dann auf eine Agarplatte mit einem Nahrungsmittelfleck, das als "Food-Race Assay" bekannt war, platziert. Der Nahrungsmittelfleck wurde auf eine Kante der Platte gelegt, während die Nematoden wVon der Nahrungsquelle entfernt. Der Ethanolentzug wurde durch Messung der Zeitdauer gemessen, die für die Würmer benötigt wurde, um den Lebensmittelfleck zu erreichen.
Dieser Nährstoff-basierte Kupfer-Aversion-Assay baut auf dem Food-Race-Assay auf, um zusätzliche Umgebungsvariablen, nämlich Nahrung und Kupfer, zu integrieren und dabei Verhaltensänderungen im Laufe der Zeit zu bewerten. Dies ist eine Anpassung eines gemeinnützigen Protokolls in der gesamten C. elegans- Gemeinschaft 4 . Dieses Protokoll wurde verwendet, um aversive Reaktionen und die Erkennung von Lebensmitteln über einen Zeitraum von vier Stunden zu bewerten 21 . Da die Wurmaussetzveranstaltungen nach 30 min Nahrungsdeprivation 25 zeigen , können wir auch beurteilen, wie sich Veränderungen des Ernährungszustands auf Umweltreaktionen auswirken können. Die Bedingungen dieses Assays messen, wie experimentelle Organismen die Reaktionsfähigkeit auf aversive Stimuli im Laufe der Zeit verändern und damit Verhaltensänderungen bewertenOrganismen Fortschritte in Richtung eines ausgehungerten Zustandes (und fortgesetzte Messungen des verlängerten Hungers). Da die npr-9 (GF) Tiere ihr Verhalten nicht als Reaktion auf Nahrung oder viele aversive Cues verändern, haben wir versucht zu erkennen, ob diese Verhaltensdefizite im Kontext des Hungers bestehen würden. Letztlich wurde dieses Assay-Design formuliert, um die npr-9 (GF) -Mutanten spezifisch zu bewerten, sondern kann auch angepasst werden, um auch neue Stämme zu charakterisieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Assay-Konstruktion modifiziert den Nahrungsmittel-Race-Assay 24 , um eine Kupferlösung zu umfassen, um eine aversive Mittellinien-Barriere und um den Rand der Platte zu schaffen, um einen Verlust von Nematoden zu verhindern. Organismen sind auf ihre Fähigkeit, die aversive Barriere zu überqueren und erreichen ein Lebensmittel-Patch über einen Zeitraum von 4 Stunden getestet. Im Kontext von npr-9 (GF) haben wir diesen Assay verwendet, um zu bewerten, wie Hungerbedingungen aversi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Naturwissenschaften und Ingenieurwissenschaften Council of Canada Discovery Grant RGPIN36481-08 an William G. Bendena unterstützt.
Materials
| M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.] | Produced in lab | ||
| Cupric Sulfate | Sigma | C-1297 | Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M |
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