EEN<em> Caenorhabditis elegans</em> Voedingsstatus gebaseerde Koper Aversion Assay

Caenorhabditis elegans is al decennia gebruikt als model voor de studie van neurobiologie door het relatieve gemak bij het analyseren van de circuits van een zenuwstelsel dat uit slechts 302 neuronen ^{1 bestaat} . Met dien verstande dat het organisme afhankelijk is van het reageren op milieu-signalen, is veel van het zenuwstelsel gewijd aan het regelen van de integratie van milieu-signalen ² . Ondanks de eenvoud van het zenuwstelsel kan C. elegans detecteren en reageren op diverse milieusignalen, waaronder afweermiddelen ³ , attractants ⁴ , temperatuur ⁵ en zelfs luchtvochtigheid ⁶ . Een niet omgevingssignalen goed geïntegreerd is gekoppeld aan een aantal gedrags- stoornissen en neurodegeneratieve ziekten in zoogdieren modelsystemen ^{7- 9.} Met een reeks beschikbare neurale ziekte modellen ¹⁰ de C. elegans en de ontwikkeling van nematode farmaceutische schermen ¹¹ , dit organisme heeft bewezen een nuttig systeem te zijn voor de studie van neurobiologie. Gezien de beschikbaarheid van een toegekende nematode Connectome ¹ en mutaties voor bijna elk gen in het nematode genoom ¹² , is ons begrip van het nematode zenuwstelsel, en door onszelf zelf, gedeeltelijk beperkt door het ontwerpen van creatief passende analyses.

In de afgelopen 40 jaar zijn een aantal chemotaxis-analyses ontwikkeld om de respons van de nematoden op diverse afersieve stimuli ^{3 , 4 , 13 , 14 , 15} te evalueren. Aanvankelijke experimenten betroffen de introductie van een acute milieustimulus terwijl een enkele worm op een agarplaat stond= "Xref"> 3 ^{, 14 , 16} . Onmiddellijke veranderingen in de locomotorische reacties werden geregistreerd. Bijvoorbeeld, kan de vluchtige geurstof octanol op een haar worden aangebracht en wafted voor een neus van de nematode om de initiëring van achterwaartse beweging in wilde worms ¹⁷ te stimuleren. Meer complexe analyses zijn ook ontwikkeld om meerdere variabelen op te nemen als middel om gedragskeuze te beoordelen ¹⁸ . Een variatie van deze analyse houdt in dat er een koperoplossing wordt gebruikt om een ​​aversive midline barrier ⁴ te creëren. Een attractant, namelijk diacetyl, werd aan één kant van de chemische barrière geplaatst met worms die van de diacetylbron werden overgebracht. Worms defect voor koperen aversieve reacties kwamen direct over de barrière om de diacetyl te bereiken, terwijl wilde worms aanvankelijk door de barrière werden afgestoten. Reacties werden behaald toen worms de koperbarrière eerst naderdenZonder lange termijn waarnemingen.

Wanneer wormen worden geëvalueerd na het hebben van hongerstoestanden, is hun gevoeligheid voor milieu-stimuli afgenomen ¹⁹ . Wanneer de aversieve chemische octanol wafted voor de nematode neus, wild-type organismen stimuleren terugwaartse beweging binnen 3 – 5 s bij het eten. Nadat deze organismen gedurende 10 minuten uit voedsel zijn verwijderd, vertoonden ze een vertraagde respons van 8 – 10 s ²⁰ . Dus met verhoogde hongersnood vertoont nematoden een afgenomen respons op schadelijke milieudesignen, aangezien de zoektocht naar voedsel essentieel is voor overleving. Omgekeerd reageren nematoden die overexpressieve neuropeptide receptor 9 ( npr-9) niet reageren op octanol op of uit eten en tonen het onvermogen om te reageren op een aantal aversieve stimuli ²¹ . Deze npr-9 (GF) organismen moduleren ook hun omkeerfrequentie niet in aanwezigheid van voedsel, maar kanOmgekeerd in reactie op harde aanraakstimulaties die aanwijzen dat zij in staat zijn om achteruit voortbewegen ²¹ . We hebben ook npr-9 (LF) mutanten geëvalueerd, aangezien zij een abnormaal verminderde omkeerfrequentie vertoonden uit voedsel, maar hun gedrag kunnen moduleren in aanwezigheid van voedsel ²¹ . Het koppelen van de voedingsstaat van de worm met de introductie van acute externe stimuli heeft geholpen bij het uitleggen van de mechanismen waardoor een voedingsgerelateerde pathway de sensorische signaleringsbanen ^{22 , 23} breed kan moduleren. De aanwezigheid van voedsel in de nematodeomgeving is ook gebruikt om ethanol-terugtrekkingsreacties te evalueren ²⁴ . In dit experiment werden worms geïncubeerd in verschillende concentraties ethanol en vervolgens op een agarplaat geplaatst met een flardje voedsel dat bekend staat als een "voedselrace-assay". Het etenstapje werd op één rand van de plaat geplaatst terwijl de nematoden wEr is weggelegd van de voedselbron. Ethanol-terugtrekking werd geëvalueerd door het meten van de tijdsduur die nodig is voor wormen om de patch van voedsel te bereiken.

Deze voedingsgebaseerde kopersaversie-analyse bouwt voort op de voedselrace-analyse om extra milieu-variabelen, namelijk voedsel en koper, te integreren, terwijl gedragsveranderingen in de loop van de tijd worden beoordeeld. Dit is een aanpassing van een algemeen gebruik protocol in de C. elegans community ⁴ . Dit protocol is gebruikt om aversieve reacties en de detectie van voedsel over een periode van vier uur ^{21 te beoordelen} . Aangezien worm's honger gedrag na 30 minuten voedselafbraak ^{25 is} , kunnen we ook evalueren hoe veranderingen in de voedingsstatus de milieueffecten kunnen beïnvloeden. De condities van deze analyse bepalen hoe experimentele organismen de responsiviteit van de aversieve stimuli over de tijd veranderen, waardoor dit gedragsveranderingen alsOrganismen vorderen naar een hongerde toestand (en voortdurende metingen van langdurige hongersnood). Aangezien de npr-9 (GF) dieren hun gedrag niet veranderen in verband met voedsel of veel aversieve signalen, trachten we te identificeren of deze gedragsmatige tekorten zouden voortzetten in het kader van hongersnood. Uiteindelijk is dit assay ontwerp geformuleerd om de npr-9 (GF) mutanten specifiek te evalueren, maar kan verder aangepast worden om ook nieuwe stammen te karakteriseren.