פפטיד, חלבון כימות באמצעות כלים אוטומטיים חיסונית-MALDI (iMALDI)
Summary
פרוטוקול עבור כימות חלבון בנוזלים ביולוגיים מורכבים באמצעות טכנולוגיית חיסונית אוטומטית-MALDI (iMALDI) מוצג.
Abstract
ספקטרומטר מסה (MS) היא אחת הטכנולוגיות הנפוצות ביותר לכימות תנועת החלבונים בדגימות מורכבים, עם ירידה לפרטים assay מעולה בעקבות זיהוי ישיר היחס בנפח גדול לתשלום של כל מולקולה היעד. עם זאת, פרוטאומיקס מבוססי MS, כמו רוב טכניקות אנליטיות אחרות, יש דעה קדומה כלפי מדידה גבוהה-שפע analytes, אז זה מאתגר כדי להשיג זיהוי גבולות של נמוך ng/mL או pg/mL דוגמאות מורכבות, וזאת הוא הטווח ריכוז עבור רבים חלבונים מחלות רלוונטיות ב biofluids כגון לפלסמה אנושית. כדי לסייע זיהוי analytes נמוך-שפע, חיסונית-העשרה שולב וזמינותו כדי להתרכז ולטהר את analyte לפני המדידה MS, באופן משמעותי לשיפור הרגישות וזמינותו. בעבודה זאת, חיסונית – הטכנולוגיה Matrix-Assisted לייזר Desorption/יינון (iMALDI) הוא הציג כימות של חלבונים ופפטידים biofluids, בהתבסס על חיסונית-העשרה על חרוזים, ואחריו MALDI-MS מדידות ללא • תנאי מוקדמת. נוגדנים אנטי-פפטיד functionalized על beads מגנטי, מודגרות עם דוגמאות. לאחר הרחצה, החרוזים מועברים ישירות לצלחת היעד MALDI, האותות נמדדת על ידי זמן-MALDI של כלי הטיסה (MALDI-TOF) לאחר הפתרון מטריקס הוחלה על החרוזים. הליך הכנת המדגם היא פשוטה יותר לעומת שאר מבחני חיסונית-MS, המדידה MALDI הוא מהיר. הכנת המדגם כולו היא אוטומטית עם נוזל טיפול במערכת, ועם הפארמצבטית assay שיפור תפוקה גבוהה יותר. במאמר זה, וזמינותו iMALDI משמש לקביעת אנגיוטנסין פפטיד של אני (אנג אני) ריכוז בפלסמה, אשר משמש קלינית readout פעילות רנין פלזמה להקרנה של ראשי aldosteronism (פי אי).
Introduction
ספקטרומטר מסה הפך להיות כלי חיוני ב פרוטאומיקס כמותית. ספקטרומטר מסה יכול לקבוע את ההמונים של חלבונים היעד או פפטידים, לכן אותות analyte שהושג יכול להיות ספציפי מאוד בהשוואה ל- immunoassays. שתי שיטות יינון, ספקטרומטריית electrospray ו- MALDI, משמשים בדרך-כלל זיהוי חלבונים ו פפטידים1,2,3,–4. האתגר העיקרי של חלבון מבוססי MS כימות טמון זיהוי חלבונים נמוכה-שפע בדגימות מורכבים בריכוזים ng/mL או pg/mL בנוכחות גבוהה-שפע חלבונים, והם רבים המועמד חלבון סמנים ביולוגיים נמצאו לפלסמה אנושית במסגרת זו בטווח5. בעיה זו נגרמת בעיקר על ידי טווח דינמי רחב מטבעו והמורכבות של האדם פרוטאום6.
כדי להתגבר על האתגרים הללו זיהוי, פותחו שיטות חיסונית-MS כדי להעשיר את היעד חלבונים או פפטידים מן הפתרונות מדגם על גבי משטח יציב, ואחריו • תנאי של analytes ו- MS מידה7,8 , 9 , 10. דרך חיסונית-העשרה, analytes וגופם מטוהר מדגימות מורכבות, ולכן ההשפעות יון-דיכוי של מולקולות אחרות הן מזעריות. בין תומך מוצקים שונים, beads מגנטי הם כיום בשימוש נרחב ביותר כפי שהם את היתרונות של נוגדנים גבוהים מחייב יכולת וקלות הטיפול. יש beads מגנטי עם functionalizations שונים וגדלים פותחה, ממוסחר לניסויים immunoprecipitation. עד כה, חיסונית-העשרה על חרוזים יש כבר לממשק עם ספקטרומטריית electrospray יינון (ESI) וגם MALDI-MS למדידה חלבון ופפטיד. איזוטופ יציב סטנדרטים, לכידת על-ידי טכנולוגיית נוגדנים אנטי-פפטיד (SISCAPA), חלבונים הדגימות מתעכלים, ואחריו הדגירה עם חרוזים מצופים נוגדן חיסונית-העשרה. ב- SISCAPA “הקלאסי”, פפטידים שנתפסו proteotypic eluted של החרוזים, נמדד על ידי נוזלי כרומטוגרפיה-ESI-MS (LC-MS), או על ידי אינפוזיה ישירה ניטור התגובה ESI-מרובה-MS (ESI-MRM-MS)11,12. חיסונית-העשרה שיפור הרגישות assay MRM מאת 3-4 סדרי גודל, להגיע לטווח נמוך ng/mL13.
בהשוואה לספקטרומטריית electrospray-MS, MALDI-MS מהר יותר, אינו כרוך equilibration מחדש של עמודות LC או ניקיון אז אין בעיות דחויים וזיהום, שהופך אותו מתאים יותר תפוקה גבוהה לימודי14. חיסונית-MALDI הטכנולוגיה פותחה במעבדה שלנו לשלב חיסונית-העשרה עם MALDI-MS על כימות רגיש וספציפי של פפטידים וחלבונים (מבוסס על כימות של פפטידים proteotypic)15,16 ,17. לאחר חיסונית-העשרה, החרוזים מופקדים על צלחת היעד MALDI, הפתרון מטריקס מתווסף חרוזים, הצלחת הוא מוכן לניתוח על ידי MALDI-תוף-MS לאחר הייבוש. • תנאי של פפטידים של החרוזים אינה מבוצעת כשלב נפרד, אך זיקה מכורך analytes הם eluted לפי הפתרון מטריקס MALDI כאשר היא מתווספת לנקודות חרוז, ובכך לפשט את הכנת הדוגמא וצמצום מדגם הפסד. IMALDI טכנולוגיה הוחל במגוון יישומים18,19, לאחרונה יש כבר אוטומטי, המשמש למדידת אנגיוטנסין אני (אנג אני) לקביעת פלזמה רנין פעילות (PRA)20. פרוטוקול זה תדגים ההליך המשמש לביצוע וזמינותו של iMALDI אוטומטית. לוקח וזמינותו PRA כדוגמה, הבין-היום CVs של פחות מ-10% הושגו באמצעות אוטומציה, עם יכולת המדידה 744 דוגמאות לכל יום20.
וזמינותו PRA iMALDI הפגינו כתב יד זה אינה דורשת עיכול חלבון, כמו המולקולה היעד (אנג אני) הוא פפטיד עם משקל מולקולרי של 1295.7 Da. מבחני אחרים לעיכול חלבון נחוץ ואיפה פפטיד משמש הפונדקאית חלבון שלם, פפטיד שנבחר עבור iMALDI צריכה להיות ייחודיות וספציפיות כדי החלבון היעד, עם גוש מעל 800 Da אז זה ניתן להבדיל בקלות בין c רעש hemical מהפתרון מטריקס MALDI. נוגדנים אנטי-פפטיד נדרשים עבור חיסונית-ההעשרה של פפטידים. הפרוטוקול עבור assay iMALDI מדידת PRA כוללת ארבעה שלבים: 1) דור של אנג לי בפלסמה אנושית; 2) חיסונית-העשרה של אנג לי באמצעות חרוזים מצופים נוגדן; 3) העברה של חרוזים MALDI המטרה צלחת, הוספת מטריקס פתרון; . ו-4) אות רכישה על-ידי MALDI-תוף-MS ונתונים ניתוח20.
Protocol
Representative Results
Discussion
לעומת חלבון מבוססי MS קונבנציונאלי כמת, iMALDI משתמש נוגדנים כדי לטהר אותם מדגימות מורכבות, ולכן כך שניתן לכמת חלבונים או פפטידים בריכוזים נמוכים ולהעשיר את analytes. שלב קריטי בפרוטוקול iMALDI הוא חיסונית-ההעשרה של פפטידים היעד. למטרה זו, יש לבחור נוגדנים עם ירידה לפרטים גבוה ואהדה. ב- SISCAPA, דווח כי ה?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים סיוע כספי מן הגנום קנדה של הגנום קולומביה הבריטית עבור פעולות (204PRO), פיתוח טכנולוגיות (214PRO) דרך רשת חידושים הגנום (ג’ין). אנו מודים פלטפורמת גילוי סמים במכון המחקר של מרכז הבריאות באוניברסיטת מקגיל לשימוש של המכשיר MALDI-TOF לצלם. מרגשת היא אסירת תודה על התמיכה של מלגת פוסט-דוקטורט מן המדע הלאומית להנדסה מחקר המועצה של קנדה (NSERC). C.H.B הוא אסיר תודה על התמיכה של הקרן הקרן החדשנית (ליף). C.H.B. הוא אסיר תודה על התמיכה היו ר סגל אוניברסיטת מקגיל אונקולוגיה מולקולרית באוניברסיטת מקגיל (מונטריאול, קוויבק, קנדה). M.X.C., C.H.B. אסירי תודה על תמיכה מ את וורן י’ סופר (מתורגם) צדקה אמון, הקרן המשפחתית על סגל אלווין לבית החולים הכללי היהודי (מונטריאול, קוויבק, קנדה).
Materials
| Healthy control human plasma | Bioreclamation | HMPLEDTA2 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830 | |
| Ammonium citrate dibasic | Sigma Aldrich | 09833 | |
| CHAPS (>=98%) | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Albumin from chicken egg white (>98%) | Sigma Aldrich | A5503 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | EDS | |
| Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma Aldrich | 78830 | |
| Trifluoroacetic acid | Thermo Fisher Scientific | 85172 | LC-MS grade |
| acetonitrile | Fluka | 34967 | LC-MS grade |
| water | Fluka | 39253 | LC-MS grade |
| acetic acid | Fluka | 320099 | LC-MS grade |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Roche Diagnostics | 3118169001 | |
| Dynabeads Protein G magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 10003D | 2.8 μm, 30 mg/mL |
| anti-Ang I goat polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-7419 | |
| Nat and SIS Ang I | synthesized at the University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre | ||
| Automated liquid handling system | Agilent | 16050-102 | Agilent Bravo robotic workstation |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Invitrogen DynaMag-2 magnet |
| Tube rotator | Theromo Scientific | 400110Q | Labquake Tube Rotator |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | DynaMag-96 side skirted magnet |
| Magnet | VP Scientific | 771RM-1 | used to pull the beads to the bottom of the well |
| MALDI-TOF | Bruker | Bruker Microflex LRF instrument |
References
- Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).
- Nicol, G. R., et al. Use of an Immunoaffinity-Mass Spectrometry-based Approach for the Quantification of Protein Biomarkers from Serum Samples of Lung Cancer Patients. Mol. & Cell. Proteomics. 7 (10), 1974-1982 (2008).
- Webster, J., Oxley, D., Zanders, E. D. . Chemical Genomics and Proteomics: Reviews and Protocols. , 227-240 (2012).
- Yergey, A. L., et al. De novo sequencing of peptides using MALDI/TOF-TOF. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 13 (7), 784-791 (2002).
- Anderson, L. Six decades searching for meaning in the proteome. J. Proteomics. 107, 24-30 (2014).
- Landegren, U., et al. Opportunities for Sensitive Plasma Proteome Analysis. Anal. Chem. 84 (4), 1824-1830 (2012).
- Guo, A., et al. Immunoaffinity Enrichment and Mass Spectrometry Analysis of Protein Methylation. Mol. & Cell. Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).
- Florentinus-Mefailoski, A., Soosaipillai, A., Dufresne, J., Diamandis, E. P., Marshall, J. G. An enzyme-linked immuno-mass spectrometric assay with the substrate adenosine monophosphate. Anal. Bioanal. Chem. 407 (4), 1119-1130 (2015).
- Fredolini, C., et al. Immunocapture strategies in translational proteomics. Expert Rev Proteomics. 13 (1), 83-98 (2016).
- Tran, J. C., et al. Automated Affinity Capture and On-Tip Digestion to Accurately Quantitate in Vivo Deamidation of Therapeutic Antibodies. Anal. Chem. , (2016).
- Razavi, M., Leigh Anderson, N., Pope, M. E., Yip, R., Pearson, T. W. High precision quantification of human plasma proteins using the automated SISCAPA Immuno-MS workflow. N. Biotechnol. 33 (5 Part A), 494-502 (2016).
- Razavi, M., et al. High-Throughput SISCAPA Quantitation of Peptides from Human Plasma Digests by Ultrafast, Liquid Chromatography-Free Mass Spectrometry. J. Proteome Res. 11 (12), 5642-5649 (2012).
- Anderson, N. L., et al. SISCAPA Peptide Enrichment on Magnetic Beads Using an In-line Bead Trap Device. Mol. & Cell. Proteomics. 8 (5), 995-1005 (2009).
- Parker, C. E., Pearson, T. W., Anderson, N. L., Borchers, C. H. Mass-spectrometry-based clinical proteomics – a review and prospective. The Analyst. 135 (8), 1830-1838 (2010).
- Reid, J. D., Holmes, D. T., Mason, D. R., Shah, B., Borchers, C. H. Towards the Development of an Immuno MALDI (iMALDI) Mass Spectrometry Assay for the Diagnosis of Hypertension. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21 (10), 1680-1686 (2010).
- Mason, D. R., Reid, J. D., Camenzind, A. G., Holmes, D. T., Borchers, C. H. Duplexed iMALDI for the detection of angiotensin I and angiotensin II. Methods. 56 (2), 213-222 (2012).
- Camenzind, A. G., vander Gugten, J. G., Popp, R., Holmes, D. T., Borchers, C. H. Development and evaluation of an immuno-MALDI (iMALDI) assay for angiotensin I and the diagnosis of secondary hypertension. Clin. Proteomics. 10 (1), 20 (2013).
- Jiang, J., et al. Development of an immuno tandem mass spectrometry (iMALDI) assay for EGFR diagnosis. Proteomics Clin Appl. 1, (2007).
- Jiang, J., Parker, C. E., Fuller, J. R., Kawula, T. H., Borchers, C. H. An Immunoaffinity Tandem Mass Spectrometry (iMALDI) assay for Detection of Francisella tularensis. Analytica chimica acta. 605 (1), 70-79 (2007).
- Popp, R. An automated assay for the clinical measurement of plasma renin activity by immuno-MALDI (iMALDI). Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1854 (6), 547-558 (2015).
- Schoenherr, R. M., et al. Automated screening of monoclonal antibodies for SISCAPA assays using a magnetic bead processor and liquid chromatography-selected reaction monitoring-mass spectrometry. J Immunol Methods. 353 (1-2), 49-61 (2010).
- Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. US patent. , (2010).
- Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. Canadian patent CA. , (2011).
- Weiß, F., et al. Catch and measure-mass spectrometry-based immunoassays in biomarker research. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1844 (5), 927-932 (2014).
- Nelson, A. L. Antibody fragments: Hope and hype. mAbs. 2 (1), 77-83 (2010).
- Gupta, V., et al. An evaluation of an aptamer for use as an affinity reagent with MS: PCSK9 as an example protein. Bioanalysis. 8 (15), 1557-1564 (2016).
