Assay voor fosforylatie en microtubulus bindende samen met lokalisatie van Tau-eiwit in Colorectal kankercellen

Tau werd oorspronkelijk geïdentificeerd als een warmte-stable microtubulus-geassocieerde proteïne, dat mede gezuiverde met tubuline^{1 was}. Tau wordt uitsluitend uitgedrukt in hogere eukaryoten^2,–^3,4. De belangrijkste functie van tau is controle microtubulus vergadering^1,5,6. Het draagt ook bij aan de polymerisatie van microtubuli⁷axonale vervoer⁸, veranderingen in axonale diameter⁹, vorming van neuroma polariteit en neurodegeneratie¹⁰. Tau fungeert ook als een eiwit steiger om te controleren enkele signaalroutes. Rat hersenen studies suggereren dat tau is neuron-specifieke en dat het voornamelijk in axonen^{11 lokaliseert}. Omdat tau essentieel voor microtubuli polymerisatie en neuronale ontwikkeling is, was tau hypothetische om te spelen een belangrijke rol in axonale ontwikkeling in het centrale zenuwstelsel; deze hypothese werd later gecontroleerd door in vitro en in vivo experimenten. Naast neuronen, wordt tau uitgedrukt in verschillende non-neuronale cellen, met inbegrip van lever, nieren en spieren cellen^12,13. Tau komt ook tot uiting in de menselijke borst, prostaat, colorectale, maag, en alvleesklier kanker cel lijnen en weefsels^{14,15,16,17,18, 19}. tau wordt ook gevonden in opname-lichaam myositis als gedraaide tubulofilaments in integratie organen²⁰.

Tau kan verschillende posttranslationele modificaties uitvoeren. Van alle posttranslationele modificaties is fosforylatie de meest voorkomende. Verhoogde tau fosforylatie vermindert zijn affiniteit voor de microtubuli, ten slotte destabiliserende het cytoskelet. Vijfentachtig fosforylatie sites zijn beschreven in tau-eiwit geïsoleerd uit menselijke Alzheimerpatiënten hersenen weefsels. Deze sites vormen 53% slechts 6% tyrosine residuen^21,22,23, serine en threonine van 41%. Tau fosforylatie van invloed is op de lokalisatie, functie, bindende, oplosbaarheid en haar gevoeligheid voor andere posttranslationele modificaties. Meer dan de normale omvang ook tau fosforylatie (of volledig verzadigd met fosfaat groepen) staat bekend als hyperphosphorylation die structurele en functionele kenmerken van de ziekte van Alzheimer²⁴repliceert. Tau onderhoudt goede werking van de axonale microtubuli en zorgt voor een normale neuronale werking onder fysiologische omstandigheden. Hyperphosphorylated tau mislukt echter om een overzichtelijk microtubulus-binding, waardoor neuronale verlies vanwege microtubulus demontage. Normale niveaus van tau fosforylatie zijn vereist voor juiste tau werking, maar tau mislukt om normaal te functioneren als haar karakteristieke fosforylatie niveau wordt gewijzigd en als het hyperphosphorylated²⁵. In de ziekte van Alzheimer en sommige andere leeftijdsgebonden neurodegeneratieve aandoeningen, tau wordt hyperphosphorylated en vormt de gepaarde spiraalvormige filamenten en neurofibrillary klitten^26,27. Dus, de methoden voor de bepaling van tau fosforylatie en microtubulus bindend zijn belangrijk.

Colorectaal carcinoom, een vergrijzing-geassocieerde kanker, is dat de derde meest voorkomende diagnose kanker en de derde prominente dood veroorzaken kanker voor mannen én vrouwen²⁸. Colorectal kanker is één van de belangrijkste dood-veroorzaakt kanker in de westerse wereld²⁹. Omdat zowel colorectale kanker en de ziekte van Alzheimer geassocieerd met vergrijzing worden en beide voornamelijk in de ontwikkelde landen waar de mensen genieten van soortgelijke voedingsgewoonten gebeuren, kunnen de twee ziekten een of andere manier worden gecorreleerd. Daarnaast reageren tau-positieve en tau-negatieve kankercellen anders op chemotherapeutische agenten, bijvoorbeeld, paclitaxel¹⁶.

Curcumine is een van de belangrijkste derivaten van Curcuma longa, de Indische specerij kurkuma³⁰. Eeuwenlang hebben de Zuid-Aziatische populaties kurkuma in hun dieet op een dagelijkse basis verbruikt. Curcumine is gebruikt voor de behandeling van verschillende ziekten, met inbegrip van colorectal kanker, de ziekte van Alzheimer, diabetes, cystic fibrosis, inflammatoire darmziekte, artritis, hyperlipidemie, atherosclerose en ischemische hartziekte^{31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38}. lithium kan ook colorectal kankercellen doden of te voorkomen dat hun proliferatie³⁹. Lithium kan ook worden gebruikt voor de behandeling van de ziekte van Alzheimer⁴⁰ zoals het tau aggregatie vermindert en de hyperphosphorylation voorkomt zoals waargenomen in een transgene muis model^{41,42,43, 44}.

Dit manuscript wil: 1) meet de totale tau en de phospho-tau expressie niveaus in de behandelde cellen; 2) beschrijven een fosfatase assay voor het meten van totale tau fosforylatie; 3) onderzoeken microtubuli-bindende voor tau; en 4) lokaliseren tau door confocale microscopie in colorectal kanker cellijnen behandeld met curcumine of LiCl. Resultaten blijkt dat de behandeling van de cel met curcumine, die een zogenaamd goede chemotherapeutische agent voor darmkanker is, en behandeling met LiCl uitdrukking van beide totale tau kan verminderen en phosphorylated tau in colorectal kanker cellijnen. Deze behandelingen kunnen ook leiden tot nucleaire translocatie van tau. Echter onverwacht, mislukt curcumine om de binding van tau tot microtubuli.