Isolamento dei mioblasti umani, valutazione della differenziazione myogenica e misurazione dell'entrata del calcio a livello di deposito

I muscoli scheletrici umani sono composti da gruppi di fibre muscolari contrattili e multinucleate derivanti dalla fusione di cellule precursori miogeniche. I muscoli scheletrici hanno la capacità di rigenerarsi dopo lesioni grazie alla presenza di SC, le cellule staminali del muscolo scheletrico situate tra la membrana plasmatica delle miofibere (sarcolemma) e la lamina basale. Nel muscolo non sinistro, gli SC sono prevalentemente presenti in uno stato quiescente. In risposta a stress meccanici o lesioni, le SC si attivano (myoblasti), si proliferano e subiscono differenze per formare nuove miofibere o auto-rinnovamento per ricostituire il pool SC ^{1 , 2} . Nel corso degli anni sono state sviluppate diverse tecniche per isolare SC e la loro progenie, i mioblasti, dalle biopsie muscolari dello scheletro. Con la maggiore comprensione dei marker di superficie delle cellule espressi su queste cellule e la metodologia della classificazione delle cellule attivata con fluorescenza (FACS) ^{3, 4 , 5} , è ora possibile isolare popolazioni puro di mioblasti umane dai campioni muscolari.

La segnalazione del calcio regola lo sviluppo muscolare scheletrico, l'omeostasi e la rigenerazione. In particolare, la voce Ca ²⁺ attivata dopo l'esaurimento intracellulare del negozio, chiamata SOCE, è di grande importanza ⁶ per questi processi. Con la stimolazione cellulare, il livello Ca ²⁺ nel reticolo endo / sarcoplasmatico (ER / SR) diminuisce, che a sua volta attiva il canale Ca ²⁺ delle membrane plasmatiche che consentono l'ingresso di Ca ²⁺ per riempire l'ER / SR ⁷ . Le due principali proteine ​​coinvolte nella SOCE sono la proteina di interazione stromale 1 (STIM1) ER / SR Ca ²⁺ e la membrana plasmatica Ca ²⁺ canale Orai1. Il muscolo scheletrico esprime abbondantemente queste due proteine, così come altre proteine ​​delle stesse famiglie (STIM2 aNd Orai2-Orai3) ^{8 , 9} e diversi canali permeabili Ca ²⁺ della famiglia canonica potenziale recettoriale transiente (TRPC) ^{10 , 11 , 12 , 13} . La penetrazione Ca ²⁺ attraverso il percorso SOCE è di grande importanza per la formazione / rigenerazione muscolare ¹⁴ . Le mutazioni delle proteine ​​STIM1 o Orai1 hanno effetti deleteri sulla funzione muscolare, determinando principalmente l'ipotonia muscolare ¹⁵ . Modelli animali con insufficienza SOCE mostrano anche ridotta massa muscolare e della forza, insieme con una maggiore affaticabilità ^{6, 16, 17.} Come già accennato, altre proteine ​​di STIM e Orai, così come molti canali TRPC, sono espresse in muscoli scheletrici, ei loro rispettivi ruoli non sono stati ancora determinati. Colpendo dPossiede il loro livello di espressione, è quindi possibile esaminare le loro implicazioni nella SOCE e nei loro ruoli durante la differenziazione muscolare scheletrica umana.

La misurazione SOCE può essere effettuata utilizzando due approcci diversi: registrazioni elettrofisiologiche di corrente e misurazioni Ca ²⁺ . L'elettrofisiologia è sicuramente un metodo più diretto, in quanto misura la corrente dell'interesse e la relativa firma elettrofisiologica. Tuttavia, questa tecnica è molto difficile applicarsi alle cellule muscolari, soprattutto a causa della grande dimensione delle cellule muscolari e della piccola dimensione della corrente SOCE endogena. L'imaging Cytosolic Ca ²⁺ è tecnicamente molto accessibile, ma la misura è più indiretta, poiché il livello Ca ²⁺ misurato nel citosol riflette sia l'ingresso di Ca ²⁺ che il riapprocco della cellula o nei negozi interni.

Una metodologia che prevede l'isolamento di mioblasti da piccoli pezzi di scafo umanoIl muscolo etale dopo la digestione enzimatica, l'amplificazione e la FACS è spiegato in questo articolo. Il processo di differenziamento muscolare e il protocollo immunofluorescenza per seguire l'espressione dei marcatori di differenziazione nel tempo sono descritti ^18. Infine, si spiega la misurazione del SOCE e il ruolo dei differenti canali ionici nella distinzione del segnale di Ca ²⁺ e della differenziazione muscolare scheletrica.