Стандартизованный подход к многовидовой очистке клеток мужского германия млекопитающих с помощью механической диссоциации тканей и проточной цитометрии

Учитывая отсутствие системы in vitro , представляющей прогрессию сперматогенеза, а также наличие большой клеточной гетерогенности в яичках, исследования биологии клеток мужских половых клеток требуют надежных методов выделения обогащенных популяций конкретных типов клеток. Для этой цели широко используется флуоресцентная сортировка клеток (FACS) ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} , так как она обеспечивает высокий выход и чистоту и превосходит другие методы изоляции в количестве типов зародышевых клеток, которые она может идентифицировать и Выберите ^{6 , 7 , 8} . Принцип анализа проточной цитометрии основан на обнаружении дифференциальных световых образцов после лазерного возбуждения одиночных клеток. Когда камера проходит через лазер, она отражает / рассеивает светПри всех углах, пропорциональных размеру ячейки (прямое рассеяние, FSC) и внутриклеточной сложности (боковой разброс, SSC). См. Ormerod ⁹ для получения подробной информации о проточной цитометрии.

Мужские зародышевые клетки подвергаются специфическим модификациям в отношении содержания ДНК, структуры хроматина, размера и формы на разных стадиях сперматогенеза. Таким образом, отдельные клеточные популяции могут быть идентифицированы и разделены путем объединения рассеяния света и окрашивания ДНК флуоресцентными красителями ^{10 , 11} . Для этой цели можно использовать несколько красителей (обзор в Geisinger и Rodriguez-Casuriaga ³ ), такой как Hoechst-33342 (Hoechst), который часто использовался в проточном цитометрическом анализе клеток тестикула в течение последнего десятилетия ^{1 , 2 , 4 , 10 , 12} . UpoN возбуждение ультрафиолетовым излучением, Hoechst излучает синюю флуоресценцию, пропорциональную содержанию клеточной ДНК, тогда как красная флуоресценция отражает изменчивость структуры хроматина и уплотнения ^{1 , 13 , 14} . В результате мужские зародышевые клетки на разных стадиях дифференцировки проявляют специфические закономерности во время FACS окрашенных Hoechst одноклеточных суспензий (Ho-FACS, ^{1 , 12} ). Интересно, что из-за механизма оттока красителя, который активен только на стадии сперматогона, интенсивность синей флуоресценции Хехста не пропорциональна содержанию хроматина в этих клетках, и они группируются как побочная популяция во время Ho-FACS ¹⁵ . Кроме того, объединение Hoechst-окрашивания с иодидом пропидиума без проницаемости (PI) позволяет пользователям различать живые (отрицательные значения PI) из мертвых (PI-положительных) клеток во время FACS ¹ <Sup>, ^{2 , 10 , 12} . Эта стратегия ранее использовалась в проточных цитометрических анализах яичек зародышевых клеток и интенсивно оптимизировалась у мышей, чтобы различать до 9 типов зародышевых клеток, включая клетки на 4 разных стадиях мейоза I ^{1 , 2 , 4 , 16} . Для целей этой работы окрашивание Hoechst имеет три основных преимущества. Во-первых, Ho-FACS успешно применяется для выделения мужских зародышевых клеток в мышиной модели ^{1 , 2 , 12} и других грызунов, таких как крыса и морская свинка ^{17 , 18 , 19} . Во-вторых, Hoechst является клеточно-проникающим красителем и не требует мембранной проницаемости, поэтому онVes. Наконец, никакой обработки РНКазой не требуется, так как Hoechst связывается преимущественно с поли (d [AT]) последовательностями ДНК ^{1 , 20} , что означает, что РНК сохраняется и, помимо ДНК и белков, может быть использована для последующих молекулярных исследований зародышей Клеточной дифференцировки.

Несмотря на сходство в плоидности и / или бледности ДНК, наблюдаемую при анализе проточной цитометрии видов млекопитающих (рассмотренная в Geisinger и Rodriguez-Casuriaga ³ ), в протоколах, описанных для выделения мужских зародышевых клеток методом проточной цитометрии, была значительная изменчивость. В различных исследованиях использовались конкретные протоколы для диссоциации тканей и использовались различные ДНК-связывающие красители (отдельно или в комбинации) и стратегии стробирования FACS у разных модельных организмов, главным образом мыши, крысы и морской свинки. Следовательно, прямое сравнение данных, собираемых для разных видов, может быть затронутоНеиспользованные технические артефакты, возникающие в результате изменчивости между методологиями. Важно отметить, что поразительное сохранение динамики хроматина во всем сперматогенезе млекопитающих (2N-4N-2N-1N) предполагает, что стандартизованный протокол может быть поперечно применен к различным видам млекопитающих.

Целью этого исследования было разработать единый рабочий процесс, применимый к различным видам млекопитающих, путем комбинирования и адаптации ранее опубликованных методов ^{2 , 20} . Стандартизация метода для обработки тканей была достигнута путем проведения механической диссоциации для преодоления потребности в видоспецифических корректировках, необходимых для ферментативного расщепления ⁵ . Следует отметить, что механическая диссоциация ткани тестикулярного грызуна показала, что она лучше, чем ферментативное переваривание ткани ^20, и Ho-FACS одноцепочечных суспензий, генерируемых обоими методами, проявляютЭто сопоставимые результаты ⁵ . В качестве доказательства принципа этот протокол описывает параметры, используемые для выделения до 5 популяций зародышевых клеток: сперматогония (SPG); Первичный (SPC I) и вторичные сперматоциты (SPC II) и сперматиды (SPD) – круглые (rSPD) и удлиненные (eSPD). Важно отметить, что это легко осуществить в лаборатории, причем основными требованиями являются система диссоциации тканей и доступ к сортировщику клеток, оснащенному УФ-лазером. Этот рабочий процесс ( рис. 1 ) является быстрым и прямым и позволяет одновременное выделение 4 популяций зародышевых клеток из свежей ткани тестикула менее чем за 2 часа. Сокращение времени обработки имеет решающее значение для поддержания целостности сотовой связи для последующих последующих процедур. Более того, его успешная работа у 5 разных видов предполагает, что он может широко применяться в клане млекопитающих, что делает его идеальным методом для выделения зародышевых клеток для сравнительных исследований репродуктивного биола млекопитающихгия.

Этот протокол состоит из трех основных разделов, за исключением подготовительных этапов: (1) механическая диссоциация ткани яичка и (2) окрашивание тестикулярных клеток с помощью Hoechst и PI, а затем (3) сортировка FACS соответствующих сперматогенных клеток. После сбора этих обогащенных популяций различных клеток яичек млекопитающих можно использовать для широкого спектра применений. В этом протоколе описывается метод «единственного размера для всех» диссоциации для очистки мужских половых клеток от многих видов млекопитающих. В зависимости от типа исследования, которое пользователи хотят проводить с изолированными зародышевыми клетками, могут использоваться другие носители или буферы. Следующие этапы протокола предназначены для получения одноцепочечных суспензий из одного целого мышиного яичка.