Uma abordagem padronizada para a purificação multiespecífica de células germinais masculinas de mamíferos por dissociação mecânica do tecido e citometria de fluxo
Summary
Este trabalho descreve a padronização de um método para obter populações de células germinativas purificadas a partir de tecido testicular de diferentes espécies de mamíferos. É um protocolo direto que combina dissociação mecânica com testículos, manchas com Hoechst-33342 e iodeto de propídio, e classificação FACS, com amplas aplicações em estudos comparativos de biologia reprodutiva masculina.
Abstract
A classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) foi um dos métodos de escolha para isolar populações enriquecidas de células germinativas testiculares de mamíferos. Atualmente, permite a discriminação de até 9 populações de células germinativas murinas com alto rendimento e pureza. Esta alta resolução em discriminação e purificação é possível devido a mudanças únicas na estrutura e na quantidade de cromatina durante a espermatogênese. Esses padrões podem ser capturados por citometria de fluxo de células germinativas masculinas coradas com corantes fluorescentes de ligação ao DNA tais como Hoechst-33342 (Hoechst). Aqui está uma descrição detalhada de um protocolo recentemente desenvolvido para isolar células germinativas testiculares de mamíferos. Resumidamente, as suspensões de células individuais são geradas a partir do tecido testicular por dissociação mecânica, coradas duas vezes com Hoechst e iodeto de propídio (PI) e processadas por citometria de fluxo. Uma estratégia de bloqueio em série, incluindo a seleção de células vivas (PI negativo) com conteúdo de DNA diferente (intensidade Hoechst), iS usados durante a classificação FACS para discriminar até 5 tipos de células germinativas. Estes incluem, com purezas médias correspondentes (determinadas por avaliação microscópica): espermatozóides (66%), espermatites primários (71%) e secundários (85%) e espermátides (90%), mais separados em rodada (93%) e alongamento (87%) subpopulações. A execução de todo o fluxo de trabalho é direta, permite o isolamento de 4 tipos de células simultaneamente com a máquina FACS apropriada e pode ser realizada em menos de 2 h. Como o tempo de processamento reduzido é crucial para preservar a fisiologia das células ex vivo , esse método é ideal para estudos de alto débito a jusante da biologia de células germinativas masculinas. Além disso, um protocolo padronizado para a purificação multiespecífica de células germinais de mamíferos elimina fontes metodológicas de variáveis e permite que um único conjunto de reagentes seja usado para diferentes modelos de animais.
Introduction
Dada a falta de um sistema in vitro representativo da progressão da espermatogênese e a presença de grande heterogeneidade celular no testículo, estudos de biologia de células germinais masculinas requerem técnicas robustas para isolar populações enriquecidas de tipos específicos de células. A classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) tem sido amplamente utilizada para este propósito 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , pois fornece alto rendimento e pureza e supera outros métodos de isolamento no número de tipos de células germinativas que ele pode identificar e Selecione 6 , 7 , 8 . O princípio da análise de citometria de fluxo baseia-se na detecção de padrões de luz diferencial após a excitação do raio laser de células isoladas. À medida que uma célula passa pelo laser reflete / dispersa a luzEm todos os ângulos, proporcional ao tamanho da célula (dispersão para frente, FSC) e à complexidade intracelular (dispersão lateral, SSC). Veja Ormerod 9 para obter informações detalhadas sobre citometria de fluxo.
As células germinativas masculinas sofrem modificações específicas no conteúdo de DNA, estrutura da cromatina, tamanho e forma em diferentes estágios da espermatogênese. Assim, populações de células distintas podem ser identificadas e separadas pela combinação de dispersão de luz e coloração de DNA com corantes fluorescentes 10 , 11 . Vários corantes podem ser utilizados para este propósito (revisado em Geisinger e Rodriguez-Casuriaga 3 ), como Hoechst-33342 (Hoechst), que tem sido freqüentemente usado na análise de citometria de fluxo de células testiculares na última década 1 , 2 , 4 , 10 , 12 . UpoN excitação com luz UV, Hoechst emite fluorescência azul proporcional ao conteúdo de DNA celular, enquanto a fluorescência vermelha distante reflete variabilidade na estrutura da cromatina e compactação 1 , 13 , 14 . Como resultado, as células germinativas masculinas em diferentes estádios de diferenciação exibem padrões específicos durante FACS de suspensões de células individuais manchadas com Hoechst (Ho-FACS; 1 , 12 ). Curiosamente, devido a um mecanismo de efluxo de corante que é apenas ativo durante o estágio espermatogônico, a intensidade da fluorescência Hoechst azul não é proporcional ao conteúdo de cromatina nessas células e se agrupa como uma população lateral durante Ho-FACS 15 . Além disso, combinar a coloração de Hoechst com o iodeto de propídio de corante não-permeante (PI) permite aos usuários discriminar em tempo real (PI negativo) de células mortas (PI positivas) durante FACS 1 <Sup>, 2 , 10 , 12 . Esta estratégia foi anteriormente utilizada em análises de citometria de fluxo de células germinativas testiculares e otimizada amplamente no mouse para discriminar até 9 tipos de células germinativas, incluindo células em 4 estádios diferentes da meiose I 1 , 2 , 4 , 16 . Para o propósito deste trabalho, a coloração Hoechst tem três vantagens principais. Primeiro, Ho-FACS foi aplicado com sucesso ao isolamento de células germinais masculinas no modelo de mouse 1 , 2 , 12 e outros roedores, como ratos e cobaias 17 , 18 , 19 . Segundo, o Hoechst é um tinte permeável às células e não requer a permeabilização da membrana, de modo que ele preserIntegridade das células. Finalmente, nenhum tratamento com RNase é necessário, uma vez que Hoechst se liga preferencialmente a sequências de DNA de poli (d [AT]) 1 , 20 , o que significa que o ARN é preservado e, além de DNA e proteínas, pode ser usado para estudos moleculares a jusante do germe diferenciação celular.
Apesar da semelhança na ploidia de DNA e / ou mancha observada em análises de citometria de fluxo de espécies de mamíferos (revisadas em Geisinger e Rodriguez-Casuriaga 3 ), houve uma grande variabilidade nos protocolos descritos para isolamento de células germinativas masculinas por citometria de fluxo. Diferentes estudos empregaram protocolos específicos para a dissociação tecidual e utilizaram diferentes tipos de corantes de ligação ao DNA (isolados ou em combinação) e FACS em diferentes organismos modelo, principalmente o rato, o rato e a cobaia. Assim, a comparação direta de dados coletados para diferentes espécies pode ser afetada pelo tabacoArtefatos técnicos não produzidos resultantes da variabilidade entre metodologias. Importante, a conservação marcante da dinâmica da cromatina em toda a espermatogênese de mamíferos (2N-4N-2N-1N) sugere que um protocolo padronizado pode ser aplicado transversalmente a uma variedade de espécies de mamíferos.
O objetivo deste estudo foi desenvolver um único fluxo de trabalho aplicável a diferentes espécies de mamíferos, combinando e adaptando as técnicas 2 , 20 anteriormente publicadas. A padronização de um método para o processamento de tecidos foi conseguida através da dissociação mecânica para superar a necessidade de ajustes específicos da espécie necessários para a digestão enzimática 5 . Vale ressaltar que a dissociação mecânica do tecido testicular de roedores mostrou-se melhor que a digestão de tecido enzimático 20 e Ho-FACS de suspensões de células individuais geradas por ambos os métodos.Resultados comparáveis 5 . Como prova de princípio, este protocolo descreve as configurações usadas para isolar até 5 populações de células germinativas: espermatogonia (SPG); Primários (SPC I) e espermatócitos secundários (SPC II) e espermátides (SPD) – redondo (rSPD) e alongamento (eSPD). Importante, é fácil de implementar no laboratório, sendo os principais requisitos o sistema de dissociação de tecidos e acesso a um classificador de células equipado com um laser UV. Este fluxo de trabalho ( Figura 1 ) é rápido e direto e permite o isolamento simultâneo de 4 populações de células germinativas a partir de tecido testicular fresco em menos de 2 h. O tempo de processamento reduzido é crucial para manter a integridade celular para outros procedimentos a jusante. Além disso, seu desempenho bem sucedido em 5 espécies diferentes sugere que poderia ser amplamente aplicado dentro do clade de mamíferos, tornando-o o método ideal para isolar células germinativas para estudos comparativos de mamíferos reprodutores masculinos biolOgy.
Este protocolo é composto por três seções principais, além das etapas preparatórias: (1) a dissociação mecânica do tecido testicular e (2) a coloração das células testiculares com Hoechst e PI, seguido de (3) classificação FACS de células espermatogênicas relevantes. Uma vez recolhidos, estas populações enriquecidas de diferentes células germinativas testiculares de mamíferos podem ser usadas para uma ampla gama de aplicações. Este protocolo descreve um método de dissociação de "tamanho único" para purificar células germinais masculinas de diferentes espécies de mamíferos diferentes. Dependendo do tipo de estudo que os usuários desejam realizar com as células germinativas isoladas, outras mídias ou tampões podem ser usados. As seguintes etapas de protocolo são para gerar suspensões de células individuais de um testículo murino inteiro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Considerando a dinâmica de cromatina altamente conservada durante a espermatogênese em mamíferos, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um protocolo para isolar células germinais masculinas em diferentes estádios de diferenciação de diferentes tecidos testiculares de mamíferos ( Figura 1 ). Um dos principais obstáculos na aplicação de um único fluxo de trabalho a diferentes modelos animais é a necessidade de ajustes específicos das espécies, especialmente no que diz respe…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem o Hillside Animal Hospital (St. Louis, MO) para testículos para cães; Jason Arand e o laboratório do Dr. Ted Cicero na Universidade de Washington em St. Louis (WashU) para fornecer testículos de ratos e Brianne Tabers para ajudar com a coleção; Jared Hartsock e Dr. Salt's Lab em WashU para os testículos de cobaia; E o Dr. Michael Talcott na Divisão de Medicina Comparada da WashU para o testículo em porco em miniatura. Os autores também reconhecem o Alvin J. Siteman Cancer Center na Escola de Medicina da Universidade de Washington e Barnes-Jewish Hospital em St. Louis, MO, pelo uso do Siteman Flow Cytometry Core, que forneceu o serviço de classificação de células operado pelo pessoal. O Siteman Cancer Center é apoiado em parte pelo NCI Cancer Center Support Grant # P30 CA91842.
Esta pesquisa foi financiada por uma bolsa de doutorado da FCT [SFRH / BD / 51695/2011 a ACL], doações dos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos [R01HD078641 e R01MH101810 a DFC] e um contrato de pesquisa FCT [IF / 01262/2014 para AML].
Materials
| 4% paraformaldehyde | VWR | #15710 | 4% PFA, For fixing sorted cells |
| Medimachine | BD Biosciences | #340588; | System for testis dissociation |
| 1X Dulbecco modified Eagle medium | Life Technologies | #31053 | DMEM, for testis dissociation |
| Medicon | BD Biosciences | #340591 | Disaggregation cartridge for testis dissociation |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | #10082139 | FBS, for FACS ceollction |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | #H3570 | Hoecsht, For FACS staining |
| 40µm cell strainer | GREINER BIO-ONE | #89508-342 | For testis dissociation |
| 100x 15mm petri dish | Falcon | #351029 | For testis dissection |
| 5mL polypropylene round-bottom tubes | Falcon | #352063 | For FACS collection |
| 1.5mL Eppendorf tubes | VWR | #20170-650 | For FACS collection |
| 3mL needless syringe | BD Biosciences | #309657 | For testis dissociation |
| 50mL conical tube | MIDSCI | #C50R | For testis dissociation |
| Propidium Iodide | Invitrogen | #L7011 | PI, For FACS staining |
| MoFlo Legacy cell sorter | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Summit Cell Sorting software | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | #AM9625 | PBS, For microscopy |
| Microscopic glass slide | Fisher Scientific | #12-544-4 | For microscopy |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | #12-548-87 | For microscopy |
| Disposable transfer pipette (3mL) | Samco Scientific | #225 | For testis dissociation |
| DNase I | Roche | #10104159001 | For testis dissociation |
| Carbon steel surgical blade | Miltex | #4-111 | For testis dissection |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | #C10227 | For automatic cell counting |
| Trypan blue solution (0.4%) | Sigma | #T8154 | For viability staining |
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