选择依赖和独立生成CRISPR / Cas9介导的哺乳动物细胞基因敲除

稳定的遗传改变比细胞扰动的瞬时方法提供了一个优点，这可以在其效率和持续时间上变化。由于目标特异性核酸酶的发展，如锌指核酸酶1,2,3,4,5，转录激活物样效应核酸酶（TALEN） ^{6,7,8,9 ，}近年来，基因组编辑越来越普及和衍生自聚集的，定期交织的短回文重复（CRISPR）系统的RNA引导的核酸酶¹⁰ 。

CRISPR / Cas9编辑机器改编自细菌和古菌用于防御病毒感染的免疫系统ass =“xref”> 11，12，13。在这个过程中，入侵病毒序列的短的20-30nt片段被引入到基因组基因座中，作为侧重于重复单元^14,15的 “间隔物”。随后的转录和RNA加工产生小的CRISPR相关RNA ¹⁶ （crRNA），其与反式激活的crRNA17（tracrRNA）一起与效应物Cas9核酸内切酶组装。因此，crRNA提供对Cas9靶向的特异性，指导复合物切割互补的病毒DNA序列并防止进一步的感染^18,19 。目标DNA中的任何“原始孢子”序列都可以作为crRNA的来源，只要它直接与短原型相邻基序（PAM）5'相连，在化脓性链球菌 Cas9 <sup class =“xref”> 20。宿主CRISPR基因座中间隔物附近的PAM序列的缺失区分自身和非自身，防止宿主的靶向。由于其普遍性和灵活性，该生物系统已经被强力地适应于基因组编辑，使得几乎任何PAM相邻的DNA位点都可以被靶向。在该版本中，进一步的修改将crRNA和tracrRNA融合到装载到Cas9蛋白²¹中的单个引导RNA（sgRNA）组分中。

在真核细胞中Cas9和sgRNA表达后，Cas9蛋白在目标基因座处切割两条DNA链。在没有合适的同源序列区域的情况下，细胞通过非同源末端连接（NHEJ） ^22,23,24修复了该断裂，其通常引入小的缺失或很少插入。定位开放时阅读框，修复可能导致产生非功能蛋白质产物的翻译移码。相比之下，当提供具有大的同源区域的外源模板时，细胞可以通过同源性定向修复^25,26固定双链断裂。该途径允许在基因组中进行更大的精确的缺失，置换或插入，以及引入可切除的选择标记²⁷ 。

在这里，我们提出了通过这两种CRISPR / Cas9方法产生敲除细胞系的方案（ 图1A ）。 NHEJ方法使用单个sgRNA切割位点和选择无关筛选，因此需要很少的前期准备。当使用这种方法时，必须设计指导与最有可能产生敲除的转录物5'末端附近的外显子互补的RNA。自从修改在这种情况下，到基因组的离子量很小，筛选克隆克隆基于斑点印迹，其中以高通量方式评估蛋白质产物。我们使用ELAV样1蛋白（ELAVL1）敲除生产线的生成作为例子。第二种方法依赖于同源性定向修复（HDR），并使用跨越感兴趣的基因或区域的两个sgRNA切割位点，允许几十kb的缺失。在切割位点侧面具有两个具有同源性区域的质粒提供替代模板（ 图1B ），引入可选择的抗性标记，其提高敲除产生效率。该方法也可适用于引入具有适当设计的同源臂的基因修饰。在这种情况下，新的DNA片段的整合允许基于PCR的筛选（ 图1C ）。在这里，我们使用Pumilio RNA结合家族成员2（PUM2）敲除生产线的生成作为例子。