Discriminación y Caracterización de las Poblaciones Heterocelulares Usando Técnicas de Imagen Cuantitativa
Summary
Hemos desarrollado un nuevo protocolo para estudiar la dinámica de la población heterocelular en respuesta a las perturbaciones. Este manuscrito describe una plataforma basada en imágenes que produce conjuntos de datos cuantitativos para la caracterización simultánea de múltiples fenotipos celulares de poblaciones heterocelulares de una manera robusta.
Abstract
Los procesos celulares son complejos y resultan de la interacción entre múltiples tipos de células y su entorno. Las técnicas existentes de biología celular a menudo no permiten una interpretación precisa de esta interacción. Utilizando un enfoque basado en imágenes cuantitativas, presentamos un protocolo de alto contenido para caracterizar las respuestas fenotípicas dinámicas ( es decir , cambios morfológicos, proliferación, apoptosis) de poblaciones de células heterogéneas a cambios en los estímulos ambientales. Destacamos nuestra capacidad para distinguir entre tipos de células basadas en la intensidad de fluorescencia o características morfológicas inherentes dependiendo de la aplicación. Esta plataforma permite una caracterización más completa de la respuesta de la subpoblación a la perturbación mientras que utiliza tiempo más corto, cantidades más pequeñas de reactivos, y menor probabilidad de error que los ensayos tradicionales de biología celular. Sin embargo, en algunos casos, las poblaciones celulares pueden ser difíciles de identificar y cuantificar basándose en células complejasY requerirá una solución de problemas adicional; Destacamos algunas de estas circunstancias en el protocolo. Demostramos esta aplicación usando la respuesta al fármaco en un modelo de cáncer; Sin embargo, se puede aplicar con mayor facilidad a otros procesos fisiológicos. Este protocolo permite identificar subpoblaciones dentro de un sistema de co-cultivo y caracterizar la respuesta particular de cada uno a estímulos externos.
Introduction
Ensayos basados en células han sido un caballo de batalla en la investigación básica y la configuración del desarrollo de drogas. Sin embargo, las limitaciones de estos ensayos estándar se han hecho cada vez más evidentes con la discordancia entre los datos in vitro y clínicos y el fracaso de la mayoría de los fármacos para recibir la aprobación de la FDA. Aquí, presentamos un nuevo método para la utilización de imágenes cuantitativas para analizar simultáneamente los fenotipos heterocelulares en respuesta a los estímulos ambientales pertinentes co-occurring.
Los ensayos basados en células tradicionales que se usan para medir la viabilidad celular incluyen: ensayos de exclusión de azul de tripán, tinción con citometría de flujo con MTT / MTS y anexina V-FITC. Trypan azul exclusión ensayos, mientras que simple y barato, requieren un gran número de células, son mucho tiempo, y son a menudo influenciados por el usuario sesgo 1 . MTT y MTS indirectamente medir la viabilidad celular a través de mediciones de la tasa metabólica mitocondrial. Sin embargo, la actividad metabólica(Por ejemplo, los medios de comunicación o la concentración de oxígeno), lo que conduce a resultados imprecisos y evita la estandarización entre los tipos y condiciones de las células 2 , 3 . Otra desventaja principal de estas técnicas es su incapacidad para distinguir entre tipos de células múltiples – la mayoría de los sistemas biológicos son heterocelulares. Aunque los métodos de citometría de flujo tienen la capacidad de distinguir entre poblaciones de células múltiples, se requieren etiquetas de células, el muestreo dinámico es desafiante y cuando se usan células adherentes, esta aplicación se convierte en mucho tiempo y propensa a errores.
Otros importantes fenotipos celulares, incluyendo los cambios morfológicos, se producen en respuesta a los estímulos ambientales, pero no son capturados por los ensayos basados en células tradicionales. La elaboración de perfiles de los estados de las células a través de la caracterización morfológica y las similitudes de mapeo entre muestras es una herramienta poderosa e imparcial con el aBility para proveer nuevas ideas sobre muchos aspectos de la investigación básica y traslacional, incluyendo la biología celular básica y el descubrimiento de fármacos 4 . Además, se ha demostrado que la morfología de las células tumorales se correlaciona con los subtipos tumorales 5 y la agresividad 6 . Por lo tanto, es de gran interés estudiar estas características celulares y cómo se relacionan con perturbaciones ambientales específicas. Además, se pueden utilizar diferencias en las características morfológicas para discriminar entre subpoblaciones en sistemas de co-cultivo. Las células marcadoras fluorescentes tienen caídas ( es decir, alteran las propiedades celulares inherentes, consumen tiempo) y, por lo tanto, son ventajosos métodos adicionales para clasificar tipos celulares.
La imagen basada en microscopía es un método alternativo para perfilar los fenotipos celulares de una manera multiplexada, cuantitativa y robusta. En este manuscrito, aplicamos nuestra tubería de imagen cuantitativa para destacar la evoluciónDinámica de las poblaciones de células heterogéneas dentro de un tumor. Nos centramos en la interacción entre células de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y Fibroblastos Asociados al Cáncer (CAF), el tipo de células estromales más prevalente en tumores. Las CAF han sido implicadas en la iniciación tumoral, la progresión y la respuesta terapéutica; Por lo tanto, la realización de ensayos fenotípicos en las células tumorales en ausencia de CAF puede ser engañosa [ 7 , 8 , 9] . Específicamente, evaluamos los efectos de las CAFs en las células tumorales en respuesta al erlotinib, una molécula pequeña dirigida al Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico (EGFR) que se usa a menudo en el tratamiento clínico del NSCLC. Utilizamos una plataforma de cribado de alto contenido y su software de análisis de imagen que acompaña a la evaluación; Sin embargo, en un intento de hacer accesible esta metodología a otros investigadores, también hemos desarrollado un protocolo comparable de downstream usando el software de código abierto:CellProfiler 10 y CellProfiler Analyst 11 . La mayoría de los ensayos de detección de alto contenido basados en imágenes se analizan con software comercializado específico para un modelo de instrumento dado. Los resultados son difíciles de replicar en otros laboratorios con software diferente porque los algoritmos subyacentes son a menudo propietarios. Usando este oleoducto basado en imágenes, se midió la proliferación celular, la muerte y la morfología de cada subpoblación de un cultivo heterocelular en respuesta al tratamiento con fármaco utilizando tanto la clasificación basada en fluorescencia como en la morfología. El siguiente protocolo proporciona una metodología robusta para probar procesos celulares complejos.
Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol described above improves upon current cell biology assays by providing more comprehensive insights into phenotypic dynamics of multiple cell types in response to environmental perturbations while using reduced reagents and time. A major advantage of this experimental design is the ability to analyze multiple phenotypes with a single setup and generate quantitative data characterizing these phenotypes on a single cell level. One technical advantage to this platform is the ease of initial troubleshooting compared to other assays. Because this method is image-based, one is able to visualize the wells for apparent over/under seeding. It is advisable to have cells in the exponential growth phase for the duration of the experiment and not be limited by nutrient or spatial constraints or confounded by senescence due to scarce seeding. Otherwise, birth and death rates may not be reproducible between experiments. For reference, CellPD is a publicly available program for computation of birth and death rates14. Additionally, one can visualize whether adequate concentrations of dyes were added to each well. Pipetting issues in an individual well could result in missegmentation and skewed data, but can easily be detected with the aforementioned protocol.
Unfortunately, not all cell types may be amenable to this application. It is important to be able to accurately segment the nuclei and cells, therefore analysis of cells that organize in more sphere-like or clumped structures may not be suitable. For some cells, it also may be advantageous to use a cell strainer prior to seeding to ensure initial seeding of single cells. In addition, the linear classifier technique is only applicable to cell types that can be readily distinguished based on morphology features.
For the success of the protocol, it is important to first optimize the imaging conditions, as the validity of downstream analyses is dependent on the quality of the images. While here we performed experiments using a high-content screening platform, image acquisition can also be performed using any fluorescent microscope (although an automated imaging platform is ideal for high-throughput approaches). Test images should be taken prior to each imaging time point to ensure that there are no problems with the microscope or protocol. The signal to noise ratio should be high, especially for the channels that will be used for segmentation (i.e. nuclei, cell stains). Additionally, it is important to image in the optimal plane of focus. If the images are out of focus, segmentation becomes much more difficult and the calculated morphological features will likely be inaccurate. Illumination differences between fields can cause problems with image segmentation as well. Large differences in brightness make the automated selection of threshold values difficult. Additionally, if there are heterogeneous fluorescence intensities between cells, a single threshold value may not sufficiently segment all the cells in an image. In this analysis, these problems were overcome by creating masks around brighter and dimmer cell populations and segmenting each population separately.
While the phenotypes under investigation in this protocol are limited to live, dead, and morphological characterization, they can easily be expanded to investigate other features. For example, functional genetic studies can be added with RNAi, overexpression, or other chemical perturbations.
In this paper, the capabilities of the protocol to measure the response of non-small cell lung cancer cells to erlotinib in the presence and absence of CAFs was demonstrated. However, this is merely one example of the many cell types and microenvironmental parameters that can be tested. We have extended this protocol to be used with other cell types and drug studies, including primary cells isolated from patient tumors13,15.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional del Cáncer (NCI) Subvenciones U54CA143798 y U54CA143907 para establecer Ciencias Físicas-Oncología Centros (PS-OC) en el Dana-Farber Cancer Institute y la Universidad del Sur de California, respectivamente. SM Mumenthaler recibió un premio de transnetwork de PS-OC que apoyó parte de este trabajo.
Quisiéramos expresar nuestra más profunda gratitud a nuestros partidarios filantrópicos, en particular a la familia Stephenson, Emmet, Toni y Tessa, por su donación de la plataforma Operetta HCS. También queremos agradecer a J. Foo por orientación, y al Centro de Medicina Aplicada miembros del equipo de Medicina: D. Agus para la orientación clínica y mentoría, K. Patsch para las discusiones significativas con el diseño experimental, R. Rawat para la ayuda en los protocolos de análisis de imágenes , J. Katz para la asistencia técnica con la Operetta, y P. Macklin y D. Ruderman para las discusiones provechosas y la regeneración.
Materials
| RPMI-1640 | Corning | 10-040-CV | cell culture medium |
| FBS | Gemini | 100-106 | medium supplement |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15-140-122 | medium supplement |
| TC20 | Biorad | 1450102 | cell counter |
| TC20 slides with trypan blue | Biorad | 1450003 | cell counter slides |
| 96-well plates | Corning | 3904 | clear bottom black plates |
| Erlotinib | LC Laboratories | E-4007 | |
| DMSO | VWR | 317275-100ML | solution to resuspend drug |
| Hoechst | Invitrogen | H21491 | nuclear dye |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | dead cell stain |
| Cell Tracker Orange CMRA | Life Technologies | C34551 | whole cell stain |
| Operetta high content imaging system | Perkin Elmer | ||
| CellProfiler | Broad Institue | version 2.2.0 (rev 9969f42) | http://cellprofiler.org/releases/ |
| Cell culture incubator | Any cell culture incubator will be suitable – cells were cultured under 37 ºC at 5% CO2. | ||
| 15 mL Falcon conical tubes | Falcon | 14-959-53A | |
| 10 cm2 cell culture plates | TPP | 93040 |
References
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