정량적 이미징 기법을 이용한 이종 세포 집단의 차별화 및 특성 규명
Summary
우리는 섭동에 반응하여 이종 세포 집단 역학을 연구하기위한 새로운 프로토콜을 개발했다. 이 원고는 heterocellular population의 여러 세포 phenotypes의 강력한 특성화를위한 정량적 인 데이터 세트를 견고한 방식으로 생산하는 이미징 기반 플랫폼을 설명합니다.
Abstract
세포 과정은 복잡하고 여러 세포 유형과 환경 사이의 상호 작용으로 발생합니다. 현존하는 세포 생물학 기술은 종종이 상호 작용의 정확한 해석을 허용하지 않습니다. 정량적 이미징 기반 접근법을 사용하여, 우리는 환경 적 자극의 변화에 대한 이종 세포 집단의 동적 표현형 반응 ( 즉, 형태학 변화, 증식, 세포 사멸)을 특성화하기위한 고 내용 프로토콜을 제시한다. 우리는 형광 강도 또는 응용 프로그램에 따라 고유의 형태학 기능을 기반으로 세포 유형을 구별하는 우리의 능력을 강조 표시합니다. 이 플랫폼은 전통적인 세포 생물학 분석보다 짧은 시간, 적은 양의 시약 및 오류 가능성을 활용하면서 섭동에 대한 하위 집단 반응의보다 포괄적 인 특성 분석을 가능하게합니다. 그러나 어떤 경우에는 세포 집단이 복잡한 cellu를 기준으로 확인 및 정량하기가 어려울 수 있습니다lar 기능과 추가 문제 해결이 필요합니다; 우리는 프로토콜에서 이러한 상황의 일부를 강조합니다. 우리는 암 모델에서 약물에 대한 반응을 사용하여이 응용 프로그램을 시연합니다. 그러나, 그것은 다른 생리적 인 과정에 더 넓게 쉽게 적용될 수있다. 이 프로토콜은 공동 문화 시스템 내에서 하위 집단을 식별하고 각각 외부 자극에 대한 특정 반응을 특성화 할 수있게합니다.
Introduction
세포 기반 분석은 기초 연구 및 약물 개발 환경에서 중요한 역할을했습니다. 그러나 이러한 표준 분석법의 한계는 시험관 내 및 임상 데이터 간의 불일치와 대부분의 약물이 FDA 승인을받지 못함에 따라 점차 명백해졌습니다. 여기에서, 우리는 관련있는 공동 발생 환경 자극에 대한 응답으로 heterocellular phenotypes를 동시에 분석하기 위해 정량 이미징을 이용하는 새로운 방법을 제시한다.
세포 생존 능력을 측정하는 데 사용되는 전통적인 세포 기반 분석에는 trypan blue exclusion assay, MTT / MTS 및 Annexin V-FITC 유동 세포 계측법 염색이 있습니다. Trypan Blue 배제 분석은 간단하면서도 저렴하면서 많은 수의 세포가 필요하며 시간이 많이 걸리고 사용자 편향 1의 영향을 받는다. MTT 및 MTS는 미토콘드리아 신진 대사 속도 측정을 통해 간접적으로 세포 생존력을 측정합니다. 그러나, 대사 활성세포의 종류는 다른 배양 조건 (배지 또는 산소 농도)에 의해 영향을받을 수 있으며 부정확 한 결과를 초래하고 세포 유형 및 조건 2 , 3에서의 표준화를 방지합니다. 이 기술의 또 다른 주요 단점은 여러 세포 유형을 구별 할 수 없다는 것입니다. 대부분의 생물학적 시스템은 이종 세포입니다. 유동 세포 계측법은 여러 세포 집단을 구별 할 수있는 능력을 가지고 있지만 세포 표지가 필요하고 동적 시료 채취가 어려우며 부착 세포를 사용할 때이 응용 프로그램은 시간이 많이 걸리고 오류가 발생하기 쉽습니다.
형태 학적 변화를 포함하여 다른 중요한 세포 표현형은 환경 적 자극에 반응하여 발생하지만 전통적인 세포 기반 검정법에 의해 포착되지 않는다. 형태 학적 특성화 및 샘플 간의 유사성 매핑을 통해 셀 상태를 프로파일 링하는 것은 강력하고 편향되지 않은 도구로서기본 세포 생물학 및 약물 발견을 포함하여 기본 및 번역 연구의 여러 측면에 대한 새로운 통찰력 제공 4 . 또한, 종양 세포 형태는 종양 아형 5 및 공격성 6 과 상관 관계가있는 것으로 나타났다. 따라서 이러한 세포의 특징을 연구하고 특정 환경 섭동과 관련되는 방법을 연구하는 것은 큰 관심사입니다. 또한, 형태 학적 특징의 차이를 이용하여 공동 배양 시스템에서 부분 집단을 구별 할 수있다. 형광 라벨링 세포는 고유 한 세포 특성을 변경하고 시간이 오래 걸리므로 세포 유형을 분류하는 추가 방법이 유리합니다.
현미경 기반 이미징은 다중화되고 정량적이며 견고한 방식으로 세포 표현형을 프로파일 링하는 대체 방법입니다. 이 원고에서는 Evolutio를 강조하기 위해 양적 이미징 파이프 라인을 적용합니다종양 내 이종 세포 집단의 역 동성 우리는 비소 세포 폐암 (NSCLC) 세포와 종양에서 발견되는 가장 흔한 간질 세포 유형 인 암 관련 섬유 아세포 (CAF) 간의 상호 작용에 중점을 둡니다. CAF는 종양 발생, 진행 및 치료 반응에 관련되어왔다. 따라서 CAF가없는 경우 종양 세포에서 표현형 검사를 수행하는 것은 오해의 소지가있을 수 있습니다 ( 7 , 8 , 9) . 특히 우리는 NSCLC의 임상 치료에 종종 사용되는 상피 성장 인자 수용체 (EGFR)를 표적으로하는 작은 분자 인 erlotinib에 대한 반응으로 종양 세포에 대한 CAF의 효과를 평가했다. 우리는 평가를 위해 고화질 심사 플랫폼 및 관련 이미지 분석 소프트웨어를 활용했습니다. 그러나이 방법론을 다른 연구자가 이용할 수 있도록하기 위해 오픈 소스 소프트웨어를 사용하는 유사한 다운 스트림 프로토콜을 개발했습니다.CellProfiler 10 및 CellProfiler Analyst 11 . 대부분의 이미지 기반 고감도 스크리닝 분석은 특정 기기 모델에 특화된 상용 소프트웨어로 분석됩니다. 기본 알고리즘이 종종 독점적이기 때문에 다른 소프트웨어를 사용하는 다른 랩에서 결과를 복제하기가 어렵습니다. 이 이미지 기반 파이프 라인을 사용하여 형광 및 형태 기반 분류를 사용하는 약물 치료에 대한 이종 세포 배양의 각 하위 집단의 세포 증식, 사망 및 형태를 측정했습니다. 다음 프로토콜은 복잡한 셀룰러 프로세스를 프로빙하는 강력한 방법을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol described above improves upon current cell biology assays by providing more comprehensive insights into phenotypic dynamics of multiple cell types in response to environmental perturbations while using reduced reagents and time. A major advantage of this experimental design is the ability to analyze multiple phenotypes with a single setup and generate quantitative data characterizing these phenotypes on a single cell level. One technical advantage to this platform is the ease of initial troubleshooting compared to other assays. Because this method is image-based, one is able to visualize the wells for apparent over/under seeding. It is advisable to have cells in the exponential growth phase for the duration of the experiment and not be limited by nutrient or spatial constraints or confounded by senescence due to scarce seeding. Otherwise, birth and death rates may not be reproducible between experiments. For reference, CellPD is a publicly available program for computation of birth and death rates14. Additionally, one can visualize whether adequate concentrations of dyes were added to each well. Pipetting issues in an individual well could result in missegmentation and skewed data, but can easily be detected with the aforementioned protocol.
Unfortunately, not all cell types may be amenable to this application. It is important to be able to accurately segment the nuclei and cells, therefore analysis of cells that organize in more sphere-like or clumped structures may not be suitable. For some cells, it also may be advantageous to use a cell strainer prior to seeding to ensure initial seeding of single cells. In addition, the linear classifier technique is only applicable to cell types that can be readily distinguished based on morphology features.
For the success of the protocol, it is important to first optimize the imaging conditions, as the validity of downstream analyses is dependent on the quality of the images. While here we performed experiments using a high-content screening platform, image acquisition can also be performed using any fluorescent microscope (although an automated imaging platform is ideal for high-throughput approaches). Test images should be taken prior to each imaging time point to ensure that there are no problems with the microscope or protocol. The signal to noise ratio should be high, especially for the channels that will be used for segmentation (i.e. nuclei, cell stains). Additionally, it is important to image in the optimal plane of focus. If the images are out of focus, segmentation becomes much more difficult and the calculated morphological features will likely be inaccurate. Illumination differences between fields can cause problems with image segmentation as well. Large differences in brightness make the automated selection of threshold values difficult. Additionally, if there are heterogeneous fluorescence intensities between cells, a single threshold value may not sufficiently segment all the cells in an image. In this analysis, these problems were overcome by creating masks around brighter and dimmer cell populations and segmenting each population separately.
While the phenotypes under investigation in this protocol are limited to live, dead, and morphological characterization, they can easily be expanded to investigate other features. For example, functional genetic studies can be added with RNAi, overexpression, or other chemical perturbations.
In this paper, the capabilities of the protocol to measure the response of non-small cell lung cancer cells to erlotinib in the presence and absence of CAFs was demonstrated. However, this is merely one example of the many cell types and microenvironmental parameters that can be tested. We have extended this protocol to be used with other cell types and drug studies, including primary cells isolated from patient tumors13,15.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 국립 암 연구소 (NCI) 보조금 U54CA143798 및 U54CA143907에 의해 자금 지원을 받아 Dana-Farber Cancer Institute 및 Southern California 대학에서 물리 과학 종양 센터 (PS-OC)를 설립했습니다. SM Mumenthaler는이 작업 중 일부를 지원하는 PS-OC 트랜스 네트워크 상을 수상했습니다.
우리는 Operetta HCS 플랫폼을 기부 한 박애주 의자, 특히 Stephenson 가족, Emmet, Toni 및 Tessa에게 깊은 감사의 말을 전합니다. J. Foo 교수와 응용 분자 과학 센터 팀 : D. 임상 지침 및 멘토링을위한 Agus, 실험 디자인과의 의미있는 토론을위한 Patsch, R. Rawat, 이미지 분석 프로토콜 지원 , Operetta와의 기술 지원에 대한 J. Katz, 그리고 도움이되는 토론과 피드백을위한 P. Macklin과 D. Ruderman.
Materials
| RPMI-1640 | Corning | 10-040-CV | cell culture medium |
| FBS | Gemini | 100-106 | medium supplement |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15-140-122 | medium supplement |
| TC20 | Biorad | 1450102 | cell counter |
| TC20 slides with trypan blue | Biorad | 1450003 | cell counter slides |
| 96-well plates | Corning | 3904 | clear bottom black plates |
| Erlotinib | LC Laboratories | E-4007 | |
| DMSO | VWR | 317275-100ML | solution to resuspend drug |
| Hoechst | Invitrogen | H21491 | nuclear dye |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | dead cell stain |
| Cell Tracker Orange CMRA | Life Technologies | C34551 | whole cell stain |
| Operetta high content imaging system | Perkin Elmer | ||
| CellProfiler | Broad Institue | version 2.2.0 (rev 9969f42) | http://cellprofiler.org/releases/ |
| Cell culture incubator | Any cell culture incubator will be suitable – cells were cultured under 37 ºC at 5% CO2. | ||
| 15 mL Falcon conical tubes | Falcon | 14-959-53A | |
| 10 cm2 cell culture plates | TPP | 93040 |
References
- Kanemura, Y., et al. Evaluation of in vitro proliferative activity of human fetal neural stem/progenitor cells using indirect measurements of viable cells based on cellular metabolic activity. J Neurosci Res. 69 (6), 869-879 (2002).
- Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. Effects of the pH dependence of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide-formazan absorption on chemosensitivity determined by a novel tetrazolium-based assay. Cancer Res. 49 (16), 4435-4440 (1989).
- Hsu, S., et al. Green tea polyphenols induce differentiation and proliferation in epidermal keratinocytes. J Pharmacol Exp Ther. 306 (1), 29-34 (2003).
- Caicedo, J. C., Singh, S., Carpenter, A. E. Applications in image-based profiling of perturbations. Curr Opin Biotechnol. 39, 134-142 (2016).
- Sero, J. E., et al. Cell shape and the microenvironment regulate nuclear translocation of NF-kappaB in breast epithelial and tumor cells. Mol Syst Biol. 11 (3), 790 (2015).
- Chen, J. F., et al. Subclassification of prostate cancer circulating tumor cells by nuclear size reveals very small nuclear circulating tumor cells in patients with visceral metastases. Cancer. 121 (18), 3240-3251 (2015).
- Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. Fibroblast heterogeneity in the cancer wound. J Exp Med. 211 (8), 1503-1523 (2014).
- Paraiso, K. H., Smalley, K. S. Fibroblast-mediated drug resistance in cancer. Biochem Pharmacol. 85 (8), 1033-1041 (2013).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
- Jones, T. R., et al. CellProfiler Analyst: data exploration and analysis software for complex image-based screens. BMC Bioinformatics. 9, 482 (2008).
- Dao, D., et al. CellProfiler Analyst: interactive data exploration, analysis and classification of large biological image sets. Bioinformatics. 32 (20), 3210-3212 (2016).
- Garvey, C. M., et al. A high-content image-based method for quantitatively studying context-dependent cell population dynamics. Sci Rep. 6, 29752 (2016).
- Juarez, E. F., et al. Quantifying differences in cell line population dynamics using CellPD. BMC Syst Biol. 10 (1), 92 (2016).
- Mumenthaler, S. M., et al. The Impact of Microenvironmental Heterogeneity on the Evolution of Drug Resistance in Cancer Cells. Cancer Inform. 14, 19-31 (2015).
