定量的イメージング技術を用いたヘテロ細胞集団の識別と特徴付け
Summary
我々は、摂動に応答して異種細胞集団動態を研究するための新規プロトコールを開発した。この原稿では、異種細胞集団の複数の細胞表現型を堅牢な方法で同時に特性決定するための定量的データセットを作成する画像ベースのプラットフォームについて説明します。
Abstract
細胞プロセスは複雑であり、複数の細胞タイプとそれらの環境との間の相互作用から生じる。既存の細胞生物学技術は、しばしばこの相互作用の正確な解釈を可能にしない。定量的イメージングベースのアプローチを用いて、我々は、異種細胞集団の動的表現型応答（ すなわち、形態変化、増殖、アポトーシス）を環境刺激の変化に特徴付けるための高含量プロトコルを提示する。用途に応じて、蛍光強度または固有の形態学的特徴に基づいて細胞タイプを区別する能力を強調する。このプラットフォームは、伝統的な細胞生物学的アッセイより短い時間、より少ない量の試薬およびエラーの可能性を利用しながら、摂動に対する亜集団応答のより包括的な特性決定を可能にする。しかし、場合によっては、細胞集団は複雑な細胞に基づいて同定および定量するのが困難な場合があります追加機能のトラブルシューティングが必要になります。私たちはこれらの状況のいくつかを議定書で強調します。我々は、癌モデルにおける薬物に対する応答を用いて、この適用を実証する。しかし、それは他の生理学的プロセスに対してより広範に容易に適用することができる。このプロトコルは、共培養系内の亜集団を同定し、それぞれの外部刺激に対する特定の応答を特徴付けることを可能にする。
Introduction
細胞ベースのアッセイは、基礎研究および医薬品開発のセッティングにおいて重要な役割を果たしてきました。しかし、これらの標準的なアッセイの限界は、インビトロおよび臨床データ間の不一致およびFDAの承認を受けるためのほとんどの薬物の不具合によってますます明らかになってきている。ここでは、関連する共存する環境刺激に応答して異種細胞表現型を同時に分析するために、定量的イメージングを利用するための新規な方法を提示する。
細胞生存率を測定するために使用される従来の細胞ベースのアッセイには、トリパンブルー排除アッセイ、MTT / MTS、およびアネキシンV-FITCフローサイトメトリー染色が含まれる。トリパンブルー排除アッセイは、単純かつ安価でありながら多数の細胞を必要とし、時間がかかり、しばしばユーザバイアス1の影響を受ける。 MTTおよびMTSアッセイは、ミトコンドリアの代謝速度の測定を介して間接的に細胞生存率を測定する。しかしながら、代謝活性物質（培地や酸素濃度など）の影響を受ける可能性があり、不正確な結果を招き、細胞の種類や状態を問わず標準化を妨げる2,3 。これらの技術のもう一つの大きな欠点は、複数の細胞タイプを区別できないことです。ほとんどの生物システムは異種細胞です。フローサイトメトリー法は複数の細胞集団を区別する能力を有するが、細胞標識が必要であり、動的サンプリングが困難であり、付着細胞を用いる場合、この適用は時間がかかり、誤りを起こしやすい。
形態学的変化を含む他の重要な細胞表現型は、環境刺激に応答して生じるが、伝統的な細胞ベースのアッセイによっては捕捉されない。形態学的特徴付けおよびサンプル間の類似性マッピングによって細胞状態をプロファイリングすることは、a基本的な細胞生物学や創薬を含む、基礎と翻訳の研究の多くの側面に新しい洞察を提供する可能性4 。さらに、腫瘍細胞の形態学は、腫瘍亜型5および攻撃性6と相関することが示されている。したがって、これらの細胞の特徴およびそれらがどのような特定の環境摂動に関連するかを研究することは、大きな関心事である。さらに、形態学的特徴の相違を用いて、共培養系における亜集団を識別することができる。蛍光標識細胞は、欠点（ すなわち 、固有の細胞特性の変更、時間のかかる）を有し、したがって、細胞型を分類するためのさらなる方法が有利である。
顕微鏡検査に基づくイメージングは、細胞表現型を多重化し、定量的かつ堅牢な方法でプロファイリングするための代替方法である。この原稿では、定量的なイメージングパイプラインを適用して、エボリューション腫瘍内の異種細胞集団のダイナミクス。私たちは、非小細胞肺癌（NSCLC）細胞と癌関連線維芽細胞（CAF）との相互作用に焦点を当てています。 CAFは、腫瘍の開始、進行および治療応答に関与している。したがって、CAFの非存在下で腫瘍細胞に対して表現型アッセイを行うことは、誤解を招く可能性がある7,8,9。特に、本発明者らは、NSCLCの臨床処置においてしばしば使用される上皮増殖因子受容体（EGFR）を標的とする小分子であるエルロチニブに応答する腫瘍細胞に対するCAFの効果を評価した。我々は、評価のためにハイコンテンツスクリーニングプラットフォームおよびそれに付随する画像分析ソフトウェアを利用した。しかし、この方法論を他の研究者が利用できるようにするために、私たちはオープンソースソフトウェアを使って同等の下流プロトコルを開発しました。CellProfiler 10およびCellProfiler Analyst 11ほとんどの画像ベースの高含量スクリーニングアッセイは、所定の機器モデルに特有の商品化されたソフトウェアで分析される。基礎となるアルゴリズムはしばしば専有であるため、異なるソフトウェアを使用する他のラボでは結果を複製することは困難です。この画像ベースのパイプラインを用いて、蛍光および形態学的分類の両方を用いた薬物治療に応答した異種細胞培養の各亜集団の細胞増殖、死および形態を測定した。以下のプロトコルは、複雑な細胞プロセスをプロービングするための堅牢な方法を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol described above improves upon current cell biology assays by providing more comprehensive insights into phenotypic dynamics of multiple cell types in response to environmental perturbations while using reduced reagents and time. A major advantage of this experimental design is the ability to analyze multiple phenotypes with a single setup and generate quantitative data characterizing these phenotypes on a single cell level. One technical advantage to this platform is the ease of initial troubleshooting compared to other assays. Because this method is image-based, one is able to visualize the wells for apparent over/under seeding. It is advisable to have cells in the exponential growth phase for the duration of the experiment and not be limited by nutrient or spatial constraints or confounded by senescence due to scarce seeding. Otherwise, birth and death rates may not be reproducible between experiments. For reference, CellPD is a publicly available program for computation of birth and death rates14. Additionally, one can visualize whether adequate concentrations of dyes were added to each well. Pipetting issues in an individual well could result in missegmentation and skewed data, but can easily be detected with the aforementioned protocol.
Unfortunately, not all cell types may be amenable to this application. It is important to be able to accurately segment the nuclei and cells, therefore analysis of cells that organize in more sphere-like or clumped structures may not be suitable. For some cells, it also may be advantageous to use a cell strainer prior to seeding to ensure initial seeding of single cells. In addition, the linear classifier technique is only applicable to cell types that can be readily distinguished based on morphology features.
For the success of the protocol, it is important to first optimize the imaging conditions, as the validity of downstream analyses is dependent on the quality of the images. While here we performed experiments using a high-content screening platform, image acquisition can also be performed using any fluorescent microscope (although an automated imaging platform is ideal for high-throughput approaches). Test images should be taken prior to each imaging time point to ensure that there are no problems with the microscope or protocol. The signal to noise ratio should be high, especially for the channels that will be used for segmentation (i.e. nuclei, cell stains). Additionally, it is important to image in the optimal plane of focus. If the images are out of focus, segmentation becomes much more difficult and the calculated morphological features will likely be inaccurate. Illumination differences between fields can cause problems with image segmentation as well. Large differences in brightness make the automated selection of threshold values difficult. Additionally, if there are heterogeneous fluorescence intensities between cells, a single threshold value may not sufficiently segment all the cells in an image. In this analysis, these problems were overcome by creating masks around brighter and dimmer cell populations and segmenting each population separately.
While the phenotypes under investigation in this protocol are limited to live, dead, and morphological characterization, they can easily be expanded to investigate other features. For example, functional genetic studies can be added with RNAi, overexpression, or other chemical perturbations.
In this paper, the capabilities of the protocol to measure the response of non-small cell lung cancer cells to erlotinib in the presence and absence of CAFs was demonstrated. However, this is merely one example of the many cell types and microenvironmental parameters that can be tested. We have extended this protocol to be used with other cell types and drug studies, including primary cells isolated from patient tumors13,15.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立がん研究所（NCI）助成金U54CA143798とU54CA143907の資金提供を受けて、ダナファーバー癌研究所と南カリフォルニア大学で物理科学 – 腫瘍センター（PS-OC）を確立しました。 SM Mumenthalerはこの作業の一部をサポートするPS-OCトランスネットワーク賞を受賞しました。
私たちは、Operetta HCSプラットフォームの寄付について、私たちの慈善団体、特にStephenson家、Emmet、Toni、Tessaに深く感謝したいと思います。 J. Foo博士、Applied Molecular Medicineのチームメンバーでもあります。D.臨床的指導と指導のためのAgus、実験デザインとの有意義な議論のためのK. Patsch、R. Rawatによる画像解析プロトコールの支援、Operettaの技術援助のためのJ. Katz、そして有用な議論とフィードバックのためのP. MacklinとD. Ruderman。
Materials
| RPMI-1640 | Corning | 10-040-CV | cell culture medium |
| FBS | Gemini | 100-106 | medium supplement |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15-140-122 | medium supplement |
| TC20 | Biorad | 1450102 | cell counter |
| TC20 slides with trypan blue | Biorad | 1450003 | cell counter slides |
| 96-well plates | Corning | 3904 | clear bottom black plates |
| Erlotinib | LC Laboratories | E-4007 | |
| DMSO | VWR | 317275-100ML | solution to resuspend drug |
| Hoechst | Invitrogen | H21491 | nuclear dye |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | dead cell stain |
| Cell Tracker Orange CMRA | Life Technologies | C34551 | whole cell stain |
| Operetta high content imaging system | Perkin Elmer | ||
| CellProfiler | Broad Institue | version 2.2.0 (rev 9969f42) | http://cellprofiler.org/releases/ |
| Cell culture incubator | Any cell culture incubator will be suitable – cells were cultured under 37 ºC at 5% CO2. | ||
| 15 mL Falcon conical tubes | Falcon | 14-959-53A | |
| 10 cm2 cell culture plates | TPP | 93040 |
References
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