Diskriminierung und Charakterisierung von Heterocellular Populationen mit quantitativen Imaging-Techniken
Summary
Wir haben ein neuartiges Protokoll für das Studium der heterozellulären Populationsdynamik als Reaktion auf Störungen entwickelt. Dieses Manuskript beschreibt eine bildgebende Plattform, die quantitative Datensätze zur gleichzeitigen Charakterisierung mehrerer zellulärer Phänotypen heterocyclischer Populationen in einer robusten Weise erzeugt.
Abstract
Zelluläre Prozesse sind komplex und ergeben sich aus dem Zusammenspiel von mehreren Zelltypen und deren Umgebung. Bestehende zellbiologische Techniken erlauben oft keine genaue Interpretation dieses Zusammenspiels. Mit einem quantitativen bildgebenden Ansatz präsentieren wir ein hochauflösendes Protokoll zur Charakterisierung der dynamischen phänotypischen Reaktionen ( dh Morphologieveränderungen, Proliferation, Apoptose) heterogener Zellpopulationen auf Veränderungen der Umweltreize. Wir unterstreichen unsere Fähigkeit, zwischen Zelltypen zu unterscheiden, die entweder auf Fluoreszenzintensität oder inhärenten Morphologiemerkmalen je nach Anwendung basieren. Diese Plattform ermöglicht eine umfassendere Charakterisierung der Subpopulation Antwort auf Störung unter Nutzung kürzere Zeit, kleinere Mengen an Reagenzien und geringere Wahrscheinlichkeit von Fehler als herkömmliche Zellbiologie Assays. Allerdings können in einigen Fällen Zellpopulationen schwer zu identifizieren und zu quantifizieren, basierend auf komplexen celluFeatures und erfordert zusätzliche Fehlersuche; Wir heben einige dieser Umstände im Protokoll hervor. Wir zeigen diese Anwendung mit Hilfe von Medikamenten in einem Krebsmodell; Allerdings kann es leicht breiter auf andere physiologische Prozesse angewendet werden. Dieses Protokoll erlaubt es, Subpopulationen innerhalb eines Co-Kultursystems zu identifizieren und die jeweilige Antwort von jedem auf externe Reize zu charakterisieren.
Introduction
Zellbasierte Assays waren ein Arbeitspferd in Grundlagenforschung und Arzneimittelentwicklung. Allerdings sind die Einschränkungen dieser Standard-Assays zunehmend offensichtlich mit der Diskordanz zwischen in vitro und klinischen Daten und das Versagen der meisten Medikamente, um FDA-Zulassung zu erhalten. Hier stellen wir eine neuartige Methode zur Verwendung einer quantitativen Bildgebung vor, um gleichzeitig heteroelluläre Phänotypen als Reaktion auf relevante, gleichzeitig auftretende Umwelteinflüsse zu analysieren.
Herkömmliche zellbasierte Assays, die verwendet werden, um die Zelllebensfähigkeit zu messen, umfassen: Trypanblau-Ausschluss-Assays, MTT / MTS und Annexin-V-FITC-Durchflusszytometrie-Färbung. Trypan Blue Ausschluss Assays, während einfach und kostengünstig, erfordern eine große Anzahl von Zellen, sind zeitaufwendig, und werden oft von Benutzer Bias 1 beeinflusst . MTT- und MTS-Assays messen die Zelllebensfähigkeit durch Messungen der mitochondrialen metabolischen Rate indirekt. Allerdings ist die metabolische activiDie Zellen können durch unterschiedliche Kulturbedingungen (wie Medien- oder Sauerstoffkonzentration) beeinflusst werden, was zu ungenauen Ergebnissen führt und die Standardisierung über die Zelltypen und die Bedingungen 2 , 3 verhindert . Ein weiterer wichtiger Nachteil dieser Techniken ist ihre Unfähigkeit, zwischen mehreren Zelltypen zu unterscheiden – die meisten biologischen Systeme sind heterozellulär. Während Durchflusszytometrie-Verfahren die Fähigkeit haben, zwischen mehreren Zellpopulationen zu unterscheiden, sind Zelletiketten erforderlich, dynamische Abtastung ist eine Herausforderung, und bei der Verwendung von adhärenten Zellen wird diese Anwendung zeitaufwändig und fehleranfällig.
Andere wichtige zelluläre Phänotypen, einschließlich morphologischer Veränderungen, treten in Reaktion auf Umwelteinflüsse auf, werden aber nicht durch herkömmliche zellbasierte Assays erfasst. Profiling Zelle Zustände durch morphologische Charakterisierung und Abbildung Ähnlichkeiten über Proben ist ein leistungsfähiges, unvoreingenommenes Werkzeug mit dem aUm neue Erkenntnisse in viele Aspekte der grundlegenden und translationalen Forschung zu geben, einschließlich der grundlegenden Zellbiologie und der Wirkstoffforschung 4 . Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Tumorzellmorphologie mit den Tumorsubtypen 5 und der Aggressivität korreliert. Daher ist es von großem Interesse, diese zellulären Merkmale zu studieren und wie sie sich auf spezifische Umweltstörungen beziehen. Darüber hinaus kann man Unterschiede in morphologischen Merkmalen verwenden, um zwischen Subpopulationen in Co-Kultursystemen zu unterscheiden. Fluoreszenzmarkierende Zellen haben Abfälle ( dh die Veränderung der inhärenten Zelleigenschaften, zeitaufwändig) und daher sind zusätzliche Methoden zur Klassifizierung von Zelltypen vorteilhaft.
Die Mikroskopie-basierte Bildgebung ist eine alternative Methode zur Profilierung von zellulären Phänotypen in multiplexierter, quantitativer und robuster Weise. In diesem Manuskript wenden wir unsere quantitative bildgebende Pipeline an, um die evolutio hervorzuhebenNary Dynamik heterogener Zellpopulationen innerhalb eines Tumors. Wir konzentrieren uns auf die Wechselwirkung zwischen Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC) Zellen und Krebs-assoziierten Fibroblasten (CAFs), dem am häufigsten vorkommenden Stromazellen-Typ, der in Tumoren gefunden wird. CAFs wurden in Tumorinitiierung, Progression und therapeutische Reaktion verwickelt; Daher kann die Durchführung von phänotypischen Assays auf Tumorzellen in Abwesenheit von CAFs irreführend 7 , 8 , 9 sein . Insbesondere haben wir die Effekte von CAFs auf Tumorzellen als Reaktion auf Erlotinib, ein kleines Molekül, das auf den Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) abzielt, der häufig in der klinischen Behandlung von NSCLC verwendet wird, ausgewertet. Wir haben eine hochauflösende Screening-Plattform und die dazugehörige Bildanalyse-Software zur Auswertung eingesetzt. In einem Versuch, diese Methodik anderen Forschern zugänglich zu machen, haben wir auch ein vergleichbares Downstream-Protokoll mit der Open-Source-Software entwickelt:CellProfiler 10 und CellProfiler Analyst 11 . Die meisten bildbasierten High-Content-Screening-Assays werden mit kommerzieller Software analysiert, die für ein bestimmtes Instrumentenmodell spezifisch ist. Ergebnisse sind schwierig, in anderen Labors mit unterschiedlicher Software zu replizieren, weil die zugrunde liegenden Algorithmen oft proprietär sind. Unter Verwendung dieser bildbasierten Pipeline wurden Zellproliferation, Tod und Morphologie jeder Subpopulation einer heterozellulären Kultur als Reaktion auf eine medikamentöse Behandlung unter Verwendung von Fluoreszenz- und Morphologie-basierter Klassifikation gemessen. Das folgende Protokoll bietet eine robuste Methode zur Untersuchung komplexer zellulärer Prozesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol described above improves upon current cell biology assays by providing more comprehensive insights into phenotypic dynamics of multiple cell types in response to environmental perturbations while using reduced reagents and time. A major advantage of this experimental design is the ability to analyze multiple phenotypes with a single setup and generate quantitative data characterizing these phenotypes on a single cell level. One technical advantage to this platform is the ease of initial troubleshooting compared to other assays. Because this method is image-based, one is able to visualize the wells for apparent over/under seeding. It is advisable to have cells in the exponential growth phase for the duration of the experiment and not be limited by nutrient or spatial constraints or confounded by senescence due to scarce seeding. Otherwise, birth and death rates may not be reproducible between experiments. For reference, CellPD is a publicly available program for computation of birth and death rates14. Additionally, one can visualize whether adequate concentrations of dyes were added to each well. Pipetting issues in an individual well could result in missegmentation and skewed data, but can easily be detected with the aforementioned protocol.
Unfortunately, not all cell types may be amenable to this application. It is important to be able to accurately segment the nuclei and cells, therefore analysis of cells that organize in more sphere-like or clumped structures may not be suitable. For some cells, it also may be advantageous to use a cell strainer prior to seeding to ensure initial seeding of single cells. In addition, the linear classifier technique is only applicable to cell types that can be readily distinguished based on morphology features.
For the success of the protocol, it is important to first optimize the imaging conditions, as the validity of downstream analyses is dependent on the quality of the images. While here we performed experiments using a high-content screening platform, image acquisition can also be performed using any fluorescent microscope (although an automated imaging platform is ideal for high-throughput approaches). Test images should be taken prior to each imaging time point to ensure that there are no problems with the microscope or protocol. The signal to noise ratio should be high, especially for the channels that will be used for segmentation (i.e. nuclei, cell stains). Additionally, it is important to image in the optimal plane of focus. If the images are out of focus, segmentation becomes much more difficult and the calculated morphological features will likely be inaccurate. Illumination differences between fields can cause problems with image segmentation as well. Large differences in brightness make the automated selection of threshold values difficult. Additionally, if there are heterogeneous fluorescence intensities between cells, a single threshold value may not sufficiently segment all the cells in an image. In this analysis, these problems were overcome by creating masks around brighter and dimmer cell populations and segmenting each population separately.
While the phenotypes under investigation in this protocol are limited to live, dead, and morphological characterization, they can easily be expanded to investigate other features. For example, functional genetic studies can be added with RNAi, overexpression, or other chemical perturbations.
In this paper, the capabilities of the protocol to measure the response of non-small cell lung cancer cells to erlotinib in the presence and absence of CAFs was demonstrated. However, this is merely one example of the many cell types and microenvironmental parameters that can be tested. We have extended this protocol to be used with other cell types and drug studies, including primary cells isolated from patient tumors13,15.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von National Cancer Institute (NCI) Grants U54CA143798 und U54CA143907 finanziert, um Physical Sciences-Oncology Centers (PS-OCs) am Dana-Farber Cancer Institute und der University of Southern California zu etablieren. SM Mumenthaler erhielt einen PS-OC-Transnetwork-Award, der einige dieser Arbeiten unterstützte.
Wir danken unseren philanthropischen Unterstützern, besonders der Stephenson-Familie, Emmet, Toni und Tessa, für ihre Spende der Operetten-HCS-Plattform. Wir möchten uns auch bei J. Foo für die Beratung bedanken und das Team der Center for Applied Molecular Medicine: D. Agus für klinische Beratung und Mentoring, K. Patsch für aussagekräftige Diskussionen mit experimentellem Design, R. Rawat zur Unterstützung von Bildanalyseprotokollen , J. Katz für technische Unterstützung bei der Operette und P. Macklin und D. Ruderman für hilfreiche Diskussionen und Feedback.
Materials
| RPMI-1640 | Corning | 10-040-CV | cell culture medium |
| FBS | Gemini | 100-106 | medium supplement |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15-140-122 | medium supplement |
| TC20 | Biorad | 1450102 | cell counter |
| TC20 slides with trypan blue | Biorad | 1450003 | cell counter slides |
| 96-well plates | Corning | 3904 | clear bottom black plates |
| Erlotinib | LC Laboratories | E-4007 | |
| DMSO | VWR | 317275-100ML | solution to resuspend drug |
| Hoechst | Invitrogen | H21491 | nuclear dye |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | dead cell stain |
| Cell Tracker Orange CMRA | Life Technologies | C34551 | whole cell stain |
| Operetta high content imaging system | Perkin Elmer | ||
| CellProfiler | Broad Institue | version 2.2.0 (rev 9969f42) | http://cellprofiler.org/releases/ |
| Cell culture incubator | Any cell culture incubator will be suitable – cells were cultured under 37 ºC at 5% CO2. | ||
| 15 mL Falcon conical tubes | Falcon | 14-959-53A | |
| 10 cm2 cell culture plates | TPP | 93040 |
References
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