Genoma de todo el mapa de las interacciones Proteína-ADN con ChEC-seq in<em> Saccharomyces cerevisiae</em

El mapeo de los sitios de unión de factores de transcripción (FT), remodeladores de cromatina y otros factores reguladores asociados a la cromatina es clave para comprender todos los procesos basados ​​en la cromatina. Mientras que la inmunoprecipitación de cromatina y la secuenciación de alto rendimiento (ChIP-seq) enfoques se han utilizado para obtener muchas ideas importantes en la biología del genoma, tienen limitaciones notables. Recientemente hemos introducido un método alternativo, denominado cromatina endógena clivaje y de alto rendimiento de secuenciación (ChEC-seq) ¹ , para eludir estos inconvenientes.

ChIP-seq se realiza más a menudo con un paso inicial de reticulación de formaldehído (X-ChIP-seq) para preservar las interacciones proteína-ADN. Sin embargo, una serie de estudios recientes han indicado que X-ChIP-seq capta transitorios o inespecíficos interacciones proteína-ADN ^{2 , 3 , 4 , 5} <Sup>, ^{6 , 7 , 8} , dando lugar a falsos sitios de unión positiva. Además, la sonicación, comúnmente utilizada para fragmentar la cromatina en experimentos X-ChIP-seq, tiende preferentemente las regiones de cromatina abierta, lo que conduce a la recuperación sesgada de los fragmentos de estas regiones [ ^{9 , 10]} . La sonicación también produce una mezcla heterogénea de longitudes de fragmentos, limitando en última instancia la resolución del sitio de unión, aunque la adición de un paso de digestión con exonucleasa puede mejorar en gran medida la resolución ^{11 , 12} . Los métodos nativos de ChIP tales como regiones ocupadas de genomas de cromatina naturalmente aislada purificada por afinidad (ORGÁNICOS) ¹³ no usan cromatina de reticulación y fragmentos con nuclease micrococcal (MNasa), aliviando los sesgos potenciales asociados con la reticulación de formaldehído y la sonicación. Sin embargo,La solubilidad de muchas proteínas ligadas a la cromatina en las condiciones relativamente suaves requeridas para la extracción nativa de cromatina es pobre, lo que podría conducir a un rango dinámico reducido y / o falsos negativos [ ^14] .

Mientras que varias iteraciones de ChIP-seq son más comúnmente utilizados para el genoma de la cartografía de las interacciones entre proteínas y ADN, varias técnicas de cartografía basada en la fusión de proteínas de interés para diversas enzimas modificadoras del ADN también se han puesto en práctica. Uno de estos enfoques es la identificación de ADN adenina metiltransferasa (DamID) ¹⁵ , en el que una proteína de unión a cromatina de interés se fusiona genéticamente con Dam y esta fusión se expresa en células o animales, dando como resultado la metilación de secuencias GATC próximas a los sitios de unión para la proteína. DamID es ventajoso porque no depende de la inmunoprecipitación y evita así la reticulación, los anticuerpos o la solubilización de la cromatina. También se realiza in vivo . sin embargo, La resolución de DamID está limitada a la escala de kilobases y la actividad de metilación de la proteína de fusión Dam es constitutiva. Un segundo método basado en la fusión enzimática es Calling Card-seq ¹⁶ , que emplea la fusión de un factor de interés para una transposasa, dirigiendo la integración de transposones específica de sitio. Al igual que DamID, Calling Card-seq no se basa en la inmunoprecipitación y por lo tanto tiene ventajas similares, con el beneficio añadido de una mayor resolución. Sin embargo, Calling Card-seq puede estar limitado por sesgos secuenciales de transposasas y también depende de la presencia de sitios de restricción cercanos a los sitios de inserción del transposón.

Un tercer método de fusión enzimática, desarrollado en el laboratorio de Laemmli, es la cromatina endógena clivaje (ChEC) [ ^17] . En ChEC, una fusión entre una proteína asociada a la cromatina y la MNasa se expresa en células, y tras la adición de calcio para activar la MNasa, el ADN se escinde proximalmente a los sitios de unión para la proteína marcada( Figura 1 ). En combinación con Southern blotting, ChEC se ha utilizado para caracterizar la estructura de la cromatina y la proteína vinculante en un número de loci individuales en la levadura ^{17 , 18} , y se ha combinado con análisis de microarrays de baja resolución para sondar la interacción de componentes de poros nucleares con la levadura Genoma ¹⁹ . ChEC ofrece beneficios similares a DamID y Calling Card-seq, y su resolución es casi un par de bases cuando se analiza por la extensión de cebador ¹⁹ . ChEC también es controlable: la escisión de ADN robusto por MNasa depende de la adición de calcio milimolar, asegurando que la MNasa es inactiva a las concentraciones de calcio libre bajo observado en las células de levadura vivas [ ^20] .

Anteriormente, se postuló que la combinación de ChEC con secuenciación de alto rendimiento (ChEC-seq) proporcionaría mapas de alta resolución de los sitios de unión TF. De hecho, ChEC-seq generaron mapas de alta resolución de los factores reguladores generales (GRFs) Abf1, Rap1 y Reb1 de la levadura en ciernes a través del genoma ¹ . También hemos aplicado con éxito ChEC-seq al complejo modular Mediator, un coactivador transcripcional global esencial conservado ²¹ , ampliando la aplicabilidad de ChEC-seq a complejos de tamaño megadalton que no entran en contacto directo con el ADN y pueden ser difíciles de mapear por ChIP- Basado en los métodos. ChEC-seq es un método poderoso tanto para la validación independiente de los resultados de ChIP-seq como para la generación de nuevos conocimientos sobre la regulación de los procesos residentes en la cromatina. Aquí, presentamos un protocolo paso a paso para la aplicación de este método en la levadura en ciernes.