Ensaios de caracterização de romance endoteliais reguladores envolvidos na resposta inflamatória de triagem
Summary
Endotélio vascular controla firmemente o recrutamento de leucócitos. Extravasamento de leucócitos inadequado contribui para doenças inflamatórias humanas. Portanto, à procura de novos elementos reguladores de ativação endotelial é necessária projetar terapias melhoradas para desordens inflamatórias. Aqui, descrevemos uma metodologia abrangente para caracterizar o romance reguladores endoteliais que podem modificar leucócitos tráfico durante a inflamação.
Abstract
A camada endotelial é essencial para manter a homeostase do corpo, controlando muitas funções diferentes. Regulação da resposta inflamatória pela camada endotelial é crucial para lutar eficientemente contra entradas prejudiciais e ajuda na recuperação de áreas danificadas. Quando as células endoteliais são expostas a um ambiente inflamatório, tais como o componente exterior da membrana de bactérias Gram-negativas, lipopolissacarídeo (LPS), eles expressam solúveis citocinas pró-inflamatórias, como Ccl5, Cxcl1 e Cxcl10 e acionar o ativação de leucócitos em circulação. Além disso, a expressão de moléculas de adesão E-selectina, VCAM-1 e ICAM-1 na superfície endotelial permite a interação e a adesão de leucócitos ativados para a camada endotelial e eventualmente o extravasamento para o tecido inflamado. Nesse cenário, a função endotelial deve ser fortemente regulamentada porque ativação excessiva ou com defeito no recrutamento de leucócitos pode levar a desordens inflamatórias-relacionadas. Desde que muitos destes transtornos não têm um tratamento eficaz, novas estratégias com foco na camada vascular devem ser investigadas. Propomos a ensaios abrangentes que são úteis para a busca de novos reguladores endoteliais que modificar a função dos leucócitos. Analisamos a ativação endotelial usando alvos específicos expressão envolvidos no recrutamento de leucócitos (por exemplo, citocinas, quimiocinas e moléculas de adesão) com várias técnicas, incluindo: (reação em cadeia de polimerase quantitativo em tempo real RT-qPCR), western-blot, ensaios de aderência e citometria de fluxo. Essas abordagens determinar função endotelial no contexto inflamatório e são muito úteis para realizar ensaios de triagem para caracterizar o romance reguladores inflamatórios endoteliais que são potencialmente valiosos para a concepção de novas estratégias terapêuticas.
Introduction
A inflamação é uma resposta biológica benéfica contra agentes infecciosos, com o objectivo principal de eliminar o patógeno e reparar o tecido danificado. Sob certas condições, tais como infecções crônicas ou doenças auto-imunes, inflamação não resolve. Em vez disso, há uma reação anormal com a contínua infiltração de leucócitos, resultando em uma resposta imune prolongada que leva a danos nos tecidos, fibrose, perda de função e em geral, deficiência e em alguma morte de casos do paciente. Estes distúrbios humanos, catalogados como doenças inflamatórias, todos envolvem os vasos sanguíneos para o controle de extravasamento de leucócitos1,2.
As células endoteliais desempenham um papel fundamental na regulação da resposta inflamatória, controlando o tráfico de leucócitos. Quando a camada endotelial é exposta aos mediadores inflamatórios tais como LPS, o endotélio descanso ativa e expressa as citocinas pró-inflamatórias (Cxcl10 Cxcl5, Cxcl1, etc) e moléculas de adesão (E-selectina, VCAM-1 e ICAM-1) esse favor recrutamento de leucócitos para o local de infecção em circulação. Leucócitos aprontados pelas citocinas lançadas depois mediam rolando e interação com a camada endotelial através as contrapartes adesivas correspondentes: PSGL-1 e selectina α4β1 integrina a VCAM-1 e αLβ2 integrina a ICAM-1. Finalmente, os leucócitos migram da vasculatura para o foco da inflamação3.
O papel essencial do endotélio na regulação da resposta inflamatória tem sido demonstrado em ratos que foram geneticamente modificados para expressar o receptor de LPS, receptores do tipo toll 4 (TLR4), apenas sobre as células endoteliais. Estes animais endotelial-TLR4 foram capazes de responder a uma inflamação mediada por LPS e detectar a infecção gerada após a inoculação de bactérias e, consequentemente, alcançar a resolução de infecção e sobrevivência a níveis semelhantes, como o tipo selvagem ratos4 , 5.
Para o caminho de resposta inflamatória endotélio-regulado, foi postulado que a inibição em algumas fases da interação leucócito-endotélio resultaria na redução da migração trans-endotelial e um prognóstico melhor para doenças inflamatórias-relacionados. Na verdade, várias estratégias visando a interação de ativação e leucócito-endotélio endotelial foram projetadas para impedir o extravasamento de células do sistema imunológico como um tratamento para disorders inflammatory6,7.
Neste relatório, descrevemos um grupo completo de técnicas em vitro para caracterizar plenamente a atividade endotelial em resposta para os estímulo inflamatório LPS e seu papel na ativação de leucócitos e adesão à camada vascular. O modelo de célula endotelial usado neste manuscrito foi a linha de endothelial da pilha do pulmão de rato (MLEC-04), conforme descrito por Hortelano et al 8. o MLEC-04 linha de celular foi validada na literatura para ser um sistema adequado para estudar a ativação endotelial9,10. Com base em interesses de pesquisa, essas abordagens podem ser facilmente extrapoladas para qualquer endoteliais ou sistemas de leucócitos e perfil inflamatório. Uma vez que são definidos os parâmetros endoteliais nas condições selecionados, o sistema pode testar novos medicamentos sobre a experimentação proposto para avaliar a ativação vascular. Neste contexto inflamatório, as células do endotélio testadas com o composto de interesse podem ser comparadas com as condições de controle das células, e quaisquer diferenças resultantes podem informar resultado de prognóstico da droga no desenvolvimento e progressão da inflamação. Para concluir, propomos um sistema relevante para caracterizar novos alvos de drogas às células endoteliais, que podem influenciar a concepção de romance vasculares específicas terapias contra doenças inflamatórias relacionadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo endotelial descreve uma tecnologia gradual que estabelece as bases para explorar novos mecanismos envolvidos na regulação da resposta inflamatória. Essas abordagens baseiam-se no estudo da atividade endotelial estimulado por LPS e avaliar os passos críticos envolvidos no recrutamento de leucócitos durante a resposta inflamatória, especificamente: liberação de citocinas endotelial, adesão endotelial adesão de expressão e leucócitos moléculas para a camada vascular. Uma vez que os parâmetros en…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Ministerio de Economía y competitividade (MINECO) e o Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (número de concessão IERPY 1149/16 para A.L.; MPY 1410/09 para S. Hortelano); pelo MINECO através do Fondo de Investigación en Salud (FIS) (subvenções números PI11.0036 e PI14.0055 para S. Hortelano). S. Herranz foi apoiado por IERPY 1149/16 de ISCIII.
Materials
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| DMEM-F12 | Lonza | BE12-719F | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | A4503 | |
| Penicillin streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Trypsine | Lonza | BE17-160E | |
| EDTA | Sigma | ED2SS | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| Trizol | Sigma | T9424 | RNA extraction buffer |
| Isopropanol | Sigma | 33539 | |
| Ethanol absoluto | Panreac | 1,310,861,612 | |
| Pure H2O | Qiagen | 1017979 | RNAse free |
| Agarose | Pronadisa | 8020 | |
| Stain for agarose gels | Invitrogen | s33102 | |
| SuperScript III First-Strand Synth | Invitrogen | 18080051 | Reagents for RT-PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385610 | Fluorescent stain for qPCR |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well | Applied Biosystems | 4346906 | Plates for qPCR |
| U-bottom 96 well plates | Falcon | 353072 | |
| Cytometry tubes | Falcon | 352054 | |
| TX100 | Panreac | 212314 | Non-ionic surfactant |
| Tris-HCl | Panreac | 1,319,401,211 | |
| Sodium chloride | Merck | 1,064,041,000 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Sodium fluoride | Sigma | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | sigma | 13721-39-6 | |
| Protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | Reagents for bicinchoninic acid assay |
| β-mercaptoethanol | merck | 805,740 | |
| PVDF Transfer Membrane, 0.45 µm | Thermo Scientific | 88518 | |
| Tween-20 | Panreac | 1,623,121,611 | Polysorbate 20 |
| PBS | Lonza | BE17-515Q | |
| ECL | Millipore | WBKLS0500 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Collagen type I | Sigma | c8919 | |
| Acetic acid | Panreac | 1,310,081,611 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Panreac | 1,310,911,612 | |
| Crystal violet | Sigma | HT90132 | |
| Sodium citrate | Sigma | C7254 | |
| Ethanol 96% | Panreac | 1,410,851,212 | |
| CFSE | Sigma | 21888 | |
| RPMI | Lonza | BE12-115F | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Infinite M200 | Tecan | M200 | Multi mode microplate reader |
| Gel Doc 2000 | Bio-Rad | 2000 | Gel documentation system |
| StepOnePlus | Applied Biosystems | StepOnePlus | qPCR system |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | Analyzer 10 | Cytometry equipment |
| ChemiDoc MP | Bio-Rad | MP | Chemiluminescence detection system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| PECAM-1 | BD Biosciences | 553370 | Use at 10 µg/ml |
| ICAM-2 | Biolegend | 1054602 | Use at 10 µg/ml |
| E-selectin | BD Biosciences | 553749 | Use at 10 µg/ml |
| VCAM-1 | BD Biosciences | 553330 | Use at 10 µg/ml |
| ICAM-1 | Becton Dickinson | 553250 | Use at 10 µg/ml |
| anti-rat IgG-FITC | Jackson Immuno Research | 112-095-006 | Use at 10 µg/ml |
| anti armenian hamster-FITC | Jackson Immuno Research | 127-095-160 | Use at 10 µg/ml |
| Rat IgG isotyope control | Invitrogen | 10700 | Use at 10 µg/ml |
| Armenian hamster IgG isotype control | Invitrogen | PA5-33220 | Use at 10 µg/ml |
| P-IκΒ-α | Cell Signaling | 2859 | Use at 10 µg/ml |
| β-Actin | Sigma | A5441 | Use at 10 µg/ml |
| P-ERK | Cell Signaling | 9101 | Use at 10 µg/ml |
| anti-mouse HRP | GE Healthcare | LNXA931/AE | Use at 1:10000 |
| anti-rabbit HRP | GE Healthcare | LNA934V/AG | Use at 1:10000 |
| anti-rat HRP | Santa Cruz | Sc-3823 | Use at 1:10000 |
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