성숙한 슈반 세포 생성을위한 골수 유래 선조 세포의 저산소 전처리
Summary
골수 내에서 골수 간질 세포 (MSC)가 존재합니다. 우리의 프로토콜은 hypoxic preconditioning을 통해 세포의 인구를 풍요롭게하고 이후 그들이 성숙한 Schwann 세포가되도록 지시합니다.
Abstract
이 원고는 골수 간질 세포 (MSC) 집단으로부터 신경 전구 세포를 풍부하게하고 나중에 성숙한 슈반 세포 운명으로 인도하는 방법을 설명합니다. 우리는 랫드 및 인간 MSC에 일과성 저산소 상태 (16 시간 동안 1 % 산소)를 투여 한 후 상피 세포 성장 인자 (EGF) / 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF) 보충과 함께 낮은 부착 기질에 신경근으로 확장시켰다. Neurospheres는 poly-D-lysine / laminin 코팅 조직 배양 플라스틱에 뿌리고 Schwann cell-like cells (SCLCs)를 생성하기 위해 β-Heregulin, bFGF 및 혈소판 유도 성장 인자 (PDGF)가 포함 된 gliogenic cocktail에서 배양 하였다. SCLC는 E14-15 임신 Sprague Dawley 쥐에서 얻은 정제 된 Dorsal root ganglia (DRG) 뉴런으로 2 주간 공동 배양을 통한 운명을 유도했다. 성숙한 Schwann 세포는 S100β / p75 발현에 지속성을 나타내며 미엘린 분절을 형성 할 수 있습니다. 이러한 방식으로 생성 된 셀은 잠재적 인 a질병 모델링뿐만 아니라 척수 손상 후자가 세포 이식에서의 응용.
Introduction
신경 progenitors과 그 유도체의 이식은 외상성 신경 손상 1 , 2 및 neurodegeneration 3 , 4 후 치료 전략으로 약속을 보여줍니다. 임상 적용 전에, i) 줄기 / 전구 세포의자가 공급원에 접근하고 확대하기위한 방법과 ii) 관련성이 있고 성숙한 세포 유형으로 그들을 안내하는 수단 3)을 보장하는 것이 필수적이다. 척수 손상에 대한 세포 치료에 대한 우리의 관심은 성인 조직으로부터의 강력한 신경 전구 세포 공급원을 찾기 위해 노력했다.
MSCs의 subpopulation은 신경 볏에서 유래하고 쉽게 골수강에서 접근 가능합니다. 이 세포들은 뉴런과 glia 5 를 생성 할 수있는 신경 전구 세포입니다. 뇌 허혈의 동물 모델은 저산소증이 prol 뇌 내부의 신경 progenitors의 iferation 및 multipotency 6 . 이것은 골수 유래 신경 전구 세포를 확장시키는 수단으로서 저산소 전처리를 이용하는 기초였다.
손상된 척수에 Schwann 세포를 이식하면 재생이 촉진됩니다 2 . SCLCs는 gliogenic 요인 ( ie, β-Heregulin, bFGF, 및 PDGF-AA)에 보충 교재에 의하여 MSCs에서 생성 할 수 있고 그러나 표현형 불안정성을 설명 할 수있다. 성장 인자를 제거하면 섬유 아세포 유사 표현형으로 되돌아 간다. 표현형의 불안정성은 세포 이식에서 바람직하지 않은데, 이는 분화 및 발암의 위험이 있기 때문이다. Schwann 세포 전구체는 배아 말초 신경 8 내의 축삭 번들과 관련이 있기 때문에, 우리는 정화 배아 DRG 뉴런과 함께 공동 배양 SCLCs 7 ,ass = "xref"> 9. 결과 성숙 Schwann 세포는 운명 – 약혼 및 시험관 기능 7 , 9 및 생체 내 10 기능을 보여 줍니다.
MSCs에서 신경 progenitors의 농축에 대한 우리의 프로토콜은 간단하고 효율적이며 이후의 assays에 대한 세포 번호의 증가 결과입니다. coculture 플랫폼을 통한 운명을 결정한 Schwann 세포의 유도는 glial differentiation의 연구와 잠재적 인 임상 적용을위한 안정되고 기능적인 Schwann 세포의 생성을 가능하게합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
저산소 전처리 및 신경 구형 문화를 통해 신경 전구 세포를 풍부하게하기 전에 MSC의 "줄기 (stemness)"를 보존하는 것이 중요합니다. 우리의 경험으로부터 다 분화 MSC는 길쭉한 섬유 모세포와 같은 형태로 확실하게 확인 될 수 있습니다. 대조적으로, 현저한 세포 골격 스트레스 섬유를 갖는보다 편평한 사각 형태를 채택한 MSCs는 신경 세포의 운명을 쉽게 받아들이지 않으므로 버려야한다. 일?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 저산소 챔버 장치를 제공 한 Dr. Nai-Sum Wong과 기술 지원을 담당 한 Ms. Alice Lui를 인정하고자합니다.
Materials
| αMEM | Sigmaaldrich | M4526 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher scientific | 12400-024 | |
| Neurobasal medium | Thermofisher scientific | 21103-049 | |
| FBS | Biosera | FB-1280/500 | |
| B27 | Thermofisher scientific | 17504-001 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | Thermofisher scientific | PHG0313 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B/100UG | |
| Nerve growth factor (NGF) | Millipore | NC011 | |
| Platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA) | Peprotech | 100-13A | |
| Heregulin beta-3, EGF domain (β-Her) | Millipore | 01-201 | |
| Uridine | Sigmaaldrich | U3003 | |
| 5-Fluro-2' – deoxyuridine (FDU) | Sigmaaldrich | F0503 | |
| Poly-D-lysine (PDL) | Sigmaaldrich | P7886-1G | |
| Laminin | Thermofisher scientific | 23017015 | |
| GlutaMAX | Thermofisher scientific | 35050061 | |
| Penicillin / streptomycin (P/S) | Thermofisher Scientific | 15140-122 | |
| TrypLE Express | Thermofisher Scientific | 12604-013 | |
| 10 cm plate for adherent culture | TPP | 93100 | Used for selection of MSCs by tissue culture adherence |
| 6-well plate for adherent culture | TPP | 92006 | Used for expansion of MSCs following passaging |
| UltraLow 6-well plate for non-adherent culture | Corning | 3471 | Used for neural progenitor enrichment |
| anti-human CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 555593 | |
| anti-human CD73 | BD Biosciences | 550256 | |
| anti-human/rat STRO-1 | R&D Systems | MAB1038 | |
| anti-human nestin | R&D Systems | MAB1259 | |
| anti-human CD45 | BD Biosciences | 555480 | |
| anti-rat CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 554895 | |
| anti-rat CD73 | BD Biosciences | 551123 | |
| anti-rat nestin | BD Biosciences | MAB1259 | |
| anti-rat CD45 | BD Biosciences | 554875 | |
| Anti-S100β | Dako | Z031101 | |
| Anti-p75 | Millipore | MAB5386 | |
| Anti-GFAP | Sigmaaldrich | G3893 | |
| Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1) | Covance | MMS-435P | |
| Anti-Human nuclei | Millipore | MAB1281 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | |
| HEPES buffer | Sigmaaldrich | H4034-100G |
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