Zebrafish भ्रूण में स्थिर, गतिशील और नवजात Microtubules का विश्लेषण करने के लिए Immunolabeling का उपयोग
Summary
Immunolabeling तरीके विकासशील zebrafish मस्तिष्क में microtubules की अलग आबादी का विश्लेषण करने के लिए यहां वर्णित हैं, जो मोटे तौर पर अंय ऊतकों के लिए लागू कर रहे हैं । पहला प्रोटोकॉल immunolabeling स्थिर और गतिशील microtubules के लिए एक अनुकूलित विधि रूपरेखा । दूसरा प्रोटोकॉल छवि के लिए एक विधि प्रदान करता है और विशेष रूप से नवजात microtubules यों ।
Abstract
Microtubules (MTs) गतिशील और नाजुक संरचनाओं कि vivo मेंछवि को चुनौती दे रहे हैं, विशेष रूप से हड्डीवाला भ्रूण में कर रहे हैं । Immunolabeling तरीके यहां वर्णित है zebrafish भ्रूण के विकासशील तंत्रिका ट्यूब में MTs के विभिंन आबादी का विश्लेषण । जबकि ध्यान तंत्रिका ऊतक पर है, यह पद्धति मोटे तौर पर अंय ऊतकों के लिए लागू है । प्रक्रियाओं के मध्य somitogenesis-चरण भ्रूण (1 somite 12 somites) के लिए जल्दी के लिए अनुकूलित कर रहे हैं, लेकिन वे अपेक्षाकृत मामूली समायोजन के साथ अंय चरणों की एक श्रृंखला के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । पहले प्रोटोकॉल स्थिर और गतिशील MTs के स्थानिक वितरण का आकलन करने और छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर के साथ इन आबादियों का एक मात्रात्मक विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए एक विधि प्रदान करता है । यह दृष्टिकोण छवि microtubule गतिशीलता और वास्तविक समय में वितरण के लिए मौजूदा उपकरणों का पूरक है, ट्रांसजेनिक लाइनों या टैग constructs के परिवर्तनीय अभिव्यक्ति का उपयोग कर । वास्तव में, इस तरह के उपकरण बहुत उपयोगी हैं, लेकिन वे आसानी से गतिशील और स्थिर टन के बीच भेद नहीं है । छवि और इन अलग microtubule आबादी का विश्लेषण करने की क्षमता को समझने के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ है कोशिका ध्रुवीकरण और morphogenesis अंतर्निहित तंत्र । दूसरा प्रोटोकॉल नवजात MTs विशेष रूप से विश्लेषण करने के लिए एक तकनीक की रूपरेखा । यह समय के साथ MTs के de नोवो वृद्धि गुण कैप्चरिंग द्वारा पूरा किया जाता है, दवा nocodazole और दवा वॉशआउट के बाद एक वसूली अवधि के साथ microtubule depolymerization निंनलिखित । इस तकनीक zebrafish भ्रूण में MTs के अध्ययन के लिए अभी तक लागू नहीं किया गया है, लेकिन microtubule विधानसभा में फंसा प्रोटीन के vivo में समारोह की जांच के लिए एक मूल्यवान परख है ।
Introduction
Microtubules (MTs) α के पॉलिमर हैं-और β-tubulin कि रैखिक protofilaments में इकट्ठा, जिनमें से कई एक खोखले ट्यूब1,2फार्म करने के लिए गठबंधन. MTs संरचनाओं का ध्रुवीकरण कर रहे हैं, तेजी से बढ़ रही प्लस समाप्त होता है और धीमी गति से बढ़ रही ऋण समाप्त होता है कि centrosome या अंय microtubule-आयोजन केंद्र (MTOC)3पर लंगर डाले हैं । De नोवो एमटी गठन γ-tubulin रिंग कॉम्प्लेक्स (γ-TURC) पर nucleation द्वारा शुरू किया जाता है, जो मीट्रिक टन विधानसभा के लिए एक टेम्पलेट प्रदान करता है4. किसी भी सेल में, MTs की दो आबादी अलग दरों पर पर बारी है कि प्रतिष्ठित किया जा सकता है । गतिशील MTs गतिशील अस्थिरता5के रूप में जाना जाता है एक प्रक्रिया में विकास और संकोचन के चरणों के बीच स्विचन द्वारा अपने सेलुलर पर्यावरण का पता लगाने । गतिशील mts के विपरीत, स्थिर mts गैर-बढ़ रहे हैं और डायनेमिक mts6की तुलना में अब आधा जीवन है ।
सेल जीवविज्ञान में अनुसंधान के दशकों के लिए मीट्रिक टन संरचना और समारोह का अध्ययन करने के लिए उपकरणों की एक परिष्कृत सरणी प्रदान की गई है और इन cytoskeletal तत्वों पर ज्ञान का एक बड़ा शरीर के परिणामस्वरूप । उदाहरण के लिए, MTs स्थापना और सेल ध्रुवीकरण के रखरखाव, जो न केवल उनके आंतरिक ध्रुवीकरण करने के लिए कारण है, लेकिन यह भी स्थिर बनाम गतिशील MTs7के अंतर उपसेलुलर वितरण करने में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं, 8. इसके विपरीत, अब तक कम से अधिक जटिल तीन में मीट्रिक टन वास्तुकला और समारोह के बारे में समझा जाता है-आयामी (3-डी) वातावरण, जैसे हड्डीवाला भ्रूण इमेजिंग की चुनौती के कारण भाग में उच्च संकल्प पर मीट्रिक टन cytoskeleton । इस सीमा के बावजूद, GFP की हाल ही की पीढ़ी-व्यक्त ट्रांसजेनिक लाइनों कि लेबल mts या फ्लोरोसेंट-टैग मीट्रिक टन मार्कर के क्षणिक अभिव्यक्ति गतिशील परिवर्तन है कि MTs से गुजरना और उनके सेलुलर के बारे में हमारी समझ बढ़ गई है और zebrafish भ्रूण में विकास की भूमिका । पूरे मीट्रिक टन नेटवर्क ट्रांसजेनिक लाइनों में imaged किया जा सकता है जिसमें tubulin या तो सीधे लेबल है9 या tubulin पॉलिमर अप्रत्यक्ष रूप से मीट्रिक टन-जुड़े प्रोटीन का उपयोग कर लेबल है Doublecortin-जैसे-कळेनासे (Dclk) या Ensconsin (EMTB)10, 11. अंय लाइनें (और constructs) उत्पंन किया गया है कि विशेष रूप से लेबल मीट्रिक टन से अधिक समाप्त होता है या centrosome-लंगर ऋण के द्वारा मीट्रिक टन आंतरिक ध्रुवीयता का आकलन सक्षम समाप्त होता है11,12,13, 14. इन उपकरणों की शक्ति रहते हैं, जीवों के विकास में मीट्रिक टन गतिशीलता अध्ययन करने की क्षमता में निहित है । इस तरह के अध्ययनों से पता चला है, उदाहरण के लिए, विशिष्ट कोशिका आबादी में MTs के स्थानिक और गतिशील वितरण, morphogenesis के दौर से गुजर ऊतकों में mitotic धुरी के उंमुखीकरण (सेल डिवीजन के विमान का एक संकेतक), मीट्रिक टन बहुलक का ध्रुवीकरण के रूप में यह सेल बढ़ाव और प्रवास के रूप में प्रक्रियाओं से संबंधित है, और मीट्रिक टन विकास दर धूमकेतु गति9,13,15द्वारा निर्धारित । इन उपकरणों की सीमा है कि वे स्थिर और गतिशील मीट्रिक टन आबादी के बीच आसानी से भेदभाव नहीं है ।
रिच सेल जीवविज्ञान साहित्य से ड्राइंग, immunolabeling तरीके छवि स्थिर और गतिशील zebrafish भ्रूण में MTs यहां वर्णित हैं, जो ट्रांसजेनिक लाइनों के उपयोग के पूरक हैं । zebrafish में इस तरह के immunolabeling तरीकों का व्यापक उपयोग कुछ हद तक निर्धारण प्रक्रिया के दौरान मीट्रिक टन अखंडता के संरक्षण में कठिनाई से प्रभावित किया गया है. प्रोटोकॉल 1 , विकासशील zebrafish hindbrain के क्रॉस अनुभागों में immunolabeling कुल, डायनेमिक, और स्थिर MTs के लिए ऑप्टिमाइज़ की गई विधि को रेखांकित करता है । इसके अलावा, एक सरल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विधि इन मीट्रिक टन आबादी यों तो वर्णन किया गया है । स्थिर mts गतिशील से प्रतिष्ठित है कई पोस्ट-शोधों के संशोधनों पर आधारित α-tubulin, जैसे acetylation और detyrosination, जो समय के साथ स्थिर MTs पर संचित16,17. zebrafish भ्रूण में, acetylation सिलिअरी पर होता है और axonal mts लेकिन स्थिर चरण mts18पर नहीं, स्थिर mts का एक सबसेट के लिए इस मार्कर की उपयोगिता सीमित. इसके विपरीत, detyrosination zebrafish भ्रूण18में सभी स्थिर MTs पर घटित करने के लिए प्रकट होता है । यह पोस्ट-शोधों संशोधन α-tubulin (detyrosinated tubulin) के carboxy-टर्मिनल glutamic एसिड को उजागर करता है18 और विरोधी Glu-tubulin19का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है । हालांकि detyrosination है तरजीही पर स्थिर MTs, प्रयोगात्मक साक्ष्य इंगित करता है कि इस पोस्ट-शोधों संशोधन का एक कारण के बजाय, मीट्रिक टन स्थिरता16का परिणाम है । पारस्परिक मीट्रिक टन, गतिशील MTs से बना है, एक एंटीबॉडी, विरोधी Tyr-tubulin, कि विशेष रूप से α-tubulin19के tyrosinated रूप पहचानता का उपयोग कर प्रतिष्ठित है. इन मार्करों और फोकल इमेजिंग के साथ immunolabeling के बाद, MTs की मात्रात्मक विश्लेषण (लंबाई, संख्या, और सापेक्ष बहुतायत) विकासशील तंत्रिका ट्यूब के परिभाषित क्षेत्रों में किया जा सकता है । 3-डी छवि-संसाधन सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके इस विश्लेषण को निष्पादित करने के लिए एक सुव्यवस्थित विधि यहां प्रदान की गई है । इस विधि morphogenesis और स्थापना या सेल ध्रुवीयता की परिपक्वता20के बारे में सवाल पता करने के लिए लागू किया जा सकता है । दरअसल, स्थिर MTs के ध्रुवीकरण arrays के विस्तार कई विकासात्मक घटनाओं के साथ साथ, photoreceptor morphogenesis21, विकासशील तंत्रिका ट्यूब18 और axon गठन8में कोशिकाओं के उपर्त्वचीकरण सहित, ।
2 प्रोटोकॉल एक सेल जीवविज्ञान परख के vivo में अनुकूलन का वर्णन करने के लिए अपने विधानसभा चरण (nucleation/anchorage और विकास)22,23के दौरान MTs विश्लेषण । नवजात टन centrosome पर nucleated रहे है और बाद में मां centriole के subdistal उपांग के लिए लंगर23। एक विधि नवजात मीट्रिक टन regrowth निंनलिखित depolymerization का विश्लेषण करने के लिए वर्णित है । इस प्रोटोकॉल nocodazole उपचार पर depolymerize MTs, दवा वॉशआउट प्रक्रिया और बाद उपचार वसूली अवधि के लिए विवरण प्रदान करता है । एमटी री-ग्रोथ नियमित अंतराल पर नजर आती हैएस पोस्ट वॉशआउट कुल MTs के लिए मार्कर के साथ immunolabeling द्वारा (एंटी β-tubulin) centrosome (anti γ-tubulin) और नाभिक (4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)) के लिए मार्कर के साथ, प्रोटोकॉल 1में वर्णित सामान्य कार्यविधियों के अनुसार. इस प्रोटोकॉल के मीट्रिक टन depolymerization कदम आवश्यक है क्योंकि यह de नोवो मीट्रिक टन के विकास के बजाय मौजूदा MTs के विस्तार के आकलन में सक्षम बनाता है । इस तकनीक को अंय प्रकाशित प्रक्रियाओं से इसलिए अलग है depolymerization के अभाव में मीट्रिक टन विकास दर को मापने के लिए एक प्लस टिप मार्कर का उपयोग करके ऐसे अंत बाध्यकारी प्रोटीन के रूप में 3 ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन से जुड़े (EB3-GFP), के रूप में ट्रॅन में दिखाया गया एट अल., २०१२११। इसके अलावा, इस परख विशेष रूप से डी नोवो मीट्रिक टन विधानसभा में दोषपूर्ण भ्रूण का विश्लेषण करने के लिए उपयोगी है, जैसे कि पहले रिपोर्ट NEDD1 म्यूटेंट में भर्ती γ-tubulin centrosome के लिए बिगड़ा है, जिसके परिणामस्वरूप है अपूर्ण तंत्रिका ट्यूब गठन और ंयूरॉंस दोष24।
Protocol
आचार कथन: नीचे वर्णित प्रक्रियाओं मैरीलैंड बाल्टीमोर काउंटी पशु देखभाल दिशानिर्देश के विश्वविद्यालय का पालन करें ।
1. स्थिर और गतिशील Immunolabeling का उपयोग कर MTs का विश्लेषण (प्रोटोकॉल 1) <strong…
Representative Results
Discussion
वर्तमान में इमेजिंग मीट्रिक टन गतिशीलता के लिए प्रारंभिक zebrafish विकास में कई तरीके हैं, टैग अणुओं की लाइव इमेजिंग से फिक्स्ड ऊतक के immunolabeling के लिए11,12,13,14। हाला?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
फोकल माइक्रोस्कोप अमेरिका नेशनल साइंस फाउंडेशन (NSF), अनुदान #DBI-०७२२५६९ से धन के साथ खरीदा गया था । इस शोध को अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH/NIGMS) अनुदान #GM085290 और अमेरिका के रक्षा विभाग (DOD) अनुदान #W81XWH-16-1-0466 R.M. ब्रूस्टर को संमानित किया गया द्वारा समर्थित था । ई. ओजस्वी पूर्व कॉलेज और स्नातक विज्ञान शिक्षा कार्यक्रम, अनुदान #52008090 के माध्यम से हावर्ड ह्यूजेस चिकित्सा संस्थान से UMBC के लिए एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । सपा ब्राउन शिक्षा GAANN फैलोशिप, एक Meyerhoff स्नातक NIH/NIGMS अनुदान #GM055036 द्वारा वित्त पोषित फैलोशिप के एक अमेरिकी विभाग द्वारा समर्थित किया गया था, और एक अनुसंधान अमेरिका DOD अनुदान #W81XWH-16-1-0466 द्वारा वित्त पोषित सहायक ।
Materials
| Low Melting Point Agarose | IBI scientific | IB70050 | Only used for embedding. Prepare 4% LMP agarose by heating a solution of 4 grams LMP agarose per 100 ml 1X TBS in a microwave until polymerized. Keep warm on a 50 ˚C hot plate with the cap secured |
| Agarose | Used to treat petridishes. Prepare 1% agarose by heating a solution of 1 gram agarose per 100 ml 1X embryo medium in a microwave until polymerized. |
||
| Nocodazole | Sigma | 487928-10MG | Make stock by dissolving entire bottle of powder in distilled water and aliquoting into 500ul aliquots. Store at -20 ˚C. |
| 8% Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8-100 | Aliquot and store at -20 ˚C. |
| Kpipes | Sigma | P7643 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Tris-HCl | Sigma | T3253-500G | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | |
| NP-40 | American Bioanalyticals | AB01424 | |
| EGTA | Sigma | E3889-25G | |
| MgCl2 | Sigma | M2670-500G | |
| Normal Goat Serum | Millipore | S26-100ml | Aliquot and store at -20 ˚C. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher | BP1605 | |
| Triton-x | American Bioanalyticals | AB02025 | |
| Pronase E (non-specific Protease from Streptomyces griseus) | Sigma | P5147-1G | make stock solution by diluting 10mg per ml of ddH2O. Aliquot in 1ml aliquots and store at -20 ˚C. |
| Anti-Fade mounting medium | Invitrogen | P10144 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Prepare 50 ml DAPI solution by first combining 1 µl DAPI stock with 1 ml sterile water and then adding the DAPI/water mix to 49 ml 1X TBS; store in foil at 4 ˚C for months. |
| Mouse anti-β-tubulin | Developmental studies Hybridoma Bank | E7 | 1/200 |
| Rabbit anti-γ-tubulin | Genetex | GTX113286 | 1/500 |
| Rabbit anti-α-tubulin | Genetex | GTX108784 | 1/1000* |
| Rabbit anti-detyrosinated-tubulin | Millipore | AB3201 | 1/200-1/1000* Titrate antibody with first use of new lot. |
| Rabbit anti-tyrosinated-tubulin | Millipore | ABT171 | 1/500 |
| Mouse anti-centrin | Millipore | 04-1624 | 1/1000 |
| Goat 488 anti-rabbit | Thermofisher | A11008 | 1/500 |
| Goat 594 anti-rabbit | Thermofisher | A11012 | 1/500 |
| Goat 594 anti-mouse | Thermofisher | A11005 | 1/500 |
| Goat 488 anti-mouse | Thermofisher | A11001 | 1/500 |
| Vibratome | Vibratome | 1500 | |
| Forceps | World Precision Instruments | 555227F | |
| 100 mm petri dish | Cell treat | 229693 | |
| 35 mm petri dish | Cell treat | 229638 | |
| 50 ml falcon tube | Fisher | 14-432-22 | |
| Woven nylon mesh 70 um | Amazon.com | B0043D1SZG | |
| Micropipette | Gilson | F123602 | |
| Glass pipette | Fisher | NC-999363-9 | |
| Aquarium sealant | Amazon.com, by MarineLand | Silicone Sealer 1 oz (Tube) | |
| Ring stand | Fisher | 14-675BO | |
| Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID | Cole-Parmer | WU-06417-21 | |
| Modeling clay | Amazon.com | Sargent Art 22-4000 | Any wax or oil based non-toxic modeling clay will suffice |
| Clamp | Fisher | 02-215-466 | |
| 60ml syringe | Fisher | 14-820-11 | |
| Embryo medium (E3) | 34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O To prepare a 60X stock, dissolve the ingredients in H2O, to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 with NaOH. Autoclave. To prepare 1X medium, dilute 16.5 mL of the 60X stock to 1 L. |
||
| Blocking Solution | 50 ml TBS-NP-40 2.5 ml normal goat serum 1 g BSA 625 µl Triton-X |
||
| TBS-NP-40 (pH 7.6) | 155 mM NaCl 10 mM Tris HCl 0.1% NP-40 |
||
| 2x MAB (pH6.4) | 160 mM KPIPES 10 mM EGTA 2 mM MgCl2 |
||
| Commercial 3-D Image processing Software | PerkinElmer | Volocity (V 6.2) | |
| Dry block heater | VWR | 12621-108 | Used as a hot plate to melt agarose in Protocol 1. |
| Dissecting Microscope | Leica | MZ12 | |
| Confocal Microscope | Leica | SP5 | |
| Flat embedding mold | emsdiasum.com | BEEM 70904-01 | |
| Public domain image processing software | NIH | ImageJ (V 1.5) | |
| * Success varies by lot number |
References
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 309-322 (2008).
- Conde, C., Cáceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nat Rev Neurosci. 10 (5), 319-332 (2009).
- Kaverina, I., Straube, A. Regulation of cell migration by dynamic microtubules. Semin Cell Dev Biol. 22 (9), 968-974 (2011).
- Kollman, J. M., Merdes, A., Mourey, L., Agard, D. A. Microtubule nucleation by γ-tubulin complexes. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (11), 709-721 (2011).
- Howard, J., Hyman, A. A. Growth, fluctuation and switching at microtubule plus ends. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (8), 569-574 (2009).
- Schulze, E., Kirschner, M. Dynamic and stable populations of microtubules in cells. J Cell Biol. 104 (2), 277-288 (1987).
- Gundersen, G. G., Kalnoski, M. H., Bulinski, J. C. Distinct populations of microtubules: Tyrosinated and nontyrosinated alpha tubulin are distributed differently in vivo. Cell. 38 (3), 779-789 (1984).
- Li, R., Gundersen, G. G. Beyond polymer polarity: how the cytoskeleton builds a polarized cell. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (11), 860-873 (2008).
- Asakawa, K., Kawakami, K. A transgenic zebrafish for monitoring in vivo microtubule structures. Dev Dyn Off Publ Am Assoc Anat. 239 (10), 2695-2699 (2010).
- Wühr, M., Tan, E. S., Parker, S. K., Detrich, H. W., Mitchison, T. J. A model for cleavage plane determination in early amphibian and fish embryos. Curr Biol CB. 20 (22), 2040-2045 (2010).
- Tran, L. D., Hino, H., et al. Dynamic microtubules at the vegetal cortex predict the embryonic axis in zebrafish. Development. 139 (19), 3644-3652 (2012).
- Butler, R., Wood, J. D., Landers, J. A., Cunliffe, V. T. Genetic and chemical modulation of spastin-dependent axon outgrowth in zebrafish embryos indicates a role for impaired microtubule dynamics in hereditary spastic paraplegia. Dis Model Mech. 3 (11-12), 743-751 (2010).
- Yoo, S. K., Lam, P. -. Y., Eichelberg, M. R., Zasadil, L., Bement, W. M., Huttenlocher, A. The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish. J Cell Sci. 125 (23), 5702-5710 (2012).
- Andersen, E. F., Halloran, M. C. Centrosome movements in vivo correlate with specific neurite formation downstream of LIM homeodomain transcription factor activity. Development. 139 (19), 3590-3599 (2012).
- Lee, S. -. J. Dynamic regulation of the microtubule and actin cytoskeleton in zebrafish epiboly. Biochem Biophys Res Commun. 452 (1), 1-7 (2014).
- Bulinski, J. C., Gundersen, G. G. Stabilization and post-translational modification of microtubules during cellular morphogenesis. BioEssays. 13 (6), 285-293 (1991).
- Magiera, M. M., Janke, C. Chapter 16 – Investigating Tubulin Posttranslational Modifications with Specific Antibodies. Methods Cell Biol. 115, 247-267 (2013).
- Hong, E., Jayachandran, P., Brewster, R. The polarity protein Pard3 is required for centrosome positioning during neurulation. Dev Biol. 341 (2), 335-345 (2010).
- Westermann, S., Weber, K. Post-translational modifications regulate microtubule function. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (12), 938-948 (2003).
- Jayachandran, P., Olmo, V. N., et al. Microtubule-associated protein 1b is required for shaping the neural tube. Neural Develop. 11, 1 (2016).
- Nam, S. -. C. Role of Tau, a microtubule associated protein, in Drosophila photoreceptor morphogenesis. Genes N Y N 2000. 54 (11), 553-561 (2016).
- Abal, M., Piel, M., Bouckson-Castaing, V., Mogensen, M., Sibarita, J. -. B., Bornens, M. Microtubule release from the centrosome in migrating cells. J Cell Biol. 159 (5), 731-737 (2002).
- Delgehyr, N., Sillibourne, J., Bornens, M. Microtubule nucleation and anchoring at the centrosome are independent processes linked by ninein function. J Cell Sci. 118 (8), 1565-1575 (2005).
- Manning, J. A., Lewis, M., Koblar, S. A., Kumar, S. An essential function for the centrosomal protein NEDD1 in zebrafish development. Cell Death Differ. 17 (8), 1302-1314 (2010).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn Off Publ Am Assoc Anat. 203 (3), 253-310 (1995).
- Beck, A. P., Watt, R. M., Bonner, J. Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development. JoVE J Vis Exp. (84), e50703 (2014).
- FÖldes-Papp, Z., Demel, U., Tilz, G. P. Laser scanning confocal fluorescence microscopy: an overview. Int Immunopharmacol. 3 (13-14), 1715-1729 (2003).
- . ImageJ User Guide – IJ 1.46 Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ (2010)
- . Z-functions – ImageJ Available from: https://imagej.net/Z-functions (2017)
