בזמן אמת Iontophoresis עם Tetramethylammonium כדי לכמת את נפח השבר ואת הצרות של המוח תאיים שטח
Summary
פרוטוקול זה מתאר בזמן אמת iontophoresis, שיטה המודדת פרמטרים פיזיים של המרחב החוץ תאי (ECS) של המוח. דיפוזיה של מולקולה אינרטי משוחרר לתוך ECS משמש לחישוב השבירה נפח ECS ו צרות. זה אידיאלי עבור חקר שינויים הפיך אקוטי למוח ECS.
Abstract
סקירה זו מתארת את המושגים הבסיסיים ואת הפרוטוקול כדי לבצע בזמן אמת את יונתופורסיס (RTI) שיטה, תקן הזהב לחקור לכמת את החלל החיצוני (ECS) של המוח חי. ה- ECS מקיף את כל תאי המוח ומכיל גם נוזל אינטרסטיציאלי וגם מטריקס תאיים. הובלה של חומרים רבים הדרושים לפעילות המוח, כולל נוירוטרנסמיטורים, הורמונים, וחומרים מזינים, מתרחשת על ידי דיפוזיה באמצעות ECS. שינויים בנפח ובגיאומטריה של חלל זה מתרחשים במהלך תהליכי מוח נורמליים, כמו שינה ומצבים פתולוגיים, כמו איסכמיה. עם זאת, המבנה והרגולציה של ECS במוח, בייחוד במדינות חולות, עדיין לא נחקרו. שיטת ה- RTI מודדת שני פרמטרים פיזיים של המוח החיה: שברי נפח וצפי. נפח חלק הוא היחס של נפח רקמות שנכבשו על ידי ECS. הצב הוא מדד של הפרעה יחסית חומר נתקל בעת התפוצצות דרך המוח מוחGion לעומת בינוני ללא חסימות. ב RTI, מולקולה אינרטי הוא פעמו מן microelectrode מקור לתוך ECS המוח. כמו מולקולות מפוזרים מן המקור הזה, הריכוז המשתנה של יון נמדדת לאורך זמן באמצעות microelectrode סלקטיבי יון מיקומו בערך 100 מיקרומטר משם. מן עקומת דיפוזיה וכתוצאה מכך, הן נפח השבירה ואת הצרות ניתן לחשב. טכניקה זו כבר בשימוש פרוסות המוח ממספר מינים (כולל בני אדם) ו in vivo ללמוד שינויים חריפים כרוניים ECS. שלא כמו שיטות אחרות, RTI ניתן להשתמש כדי לבחון הן הפיך שינויים בלתי הפיך על ECS המוח בזמן אמת.
Introduction
החלל תאיים (ECS) היא רשת של ערוצי מחוברים החיצוני לכל תאי המוח ומכיל הן נוזל interstitial ו מטריקס תאיים ( איור 1 א ואיור 1b ). התפלגות של חומרים רבים הנדרשים לתפקוד תאי המוח, כולל חומרים מזינים, הורמונים, נוירוטרנסמיטורים, מתרחשת על ידי דיפוזיה באמצעות ECS. שינויים בפרמטרים הפיזיים של החלל הזה, כולל נפח, גיאומטריה, מטריקס תאיים, יכול להשפיע באופן דרסטי על דיפוזיה באמצעות ECS ו ריכוזי יונים מקומיים רחצה תאי המוח, אשר יש השפעה עמוקה על תפקוד המוח במוח 1 , 2 .
בזמן אמת iontophoresis (RTI) משמש כדי לקבוע שני מאפיינים מבניים של אזור המוח: נפח נפח ו צרות 3 , 4 ,"Xref"> 5. נפח חלק ( α ) הוא היחס של נפח רקמות שנכבשו על ידי ECS ( V ECS ) ביחס נפח הרקמה הכולל ( רקמת V ) בנפח יסוד מייצג;
Tortuosity ( λ ) היא הפרעה היחסית שחומר נתקל כאשר מתפשט דרך אזור במוח לעומת בינוני ללא חסימות;
שם * D (ס"מ 2 s -1) הוא מקדם הדיפוזיה יעילה של חומר במוח ו- D (ס"מ 2 s -1) הוא מקדם הדיפוזיה חופשי של חומר במדיום חופשי, כגון לדלל agarose ג'ל.
כיום, חומר בדיקה הנפוץ ביותר עבור Rשיטת TI היא tetramethylammonium קטיון קטן (TMA). TMA יש משקל מולקולרי של 74 גרם / מול, לחלוטין disociates בפתרון, ויש לו חיוב אחד חיובי. מחקרים RTI עם יון זה הוכיחו כי α 
0.2 ו λ 1.6 1 , 2 . משמעות הדבר היא כי ECS הוא בערך 20% מכלל נפח המוח, וכי דיפוזיה של מולקולה קטנה אינרטית מתרחשת בערך פי 2.5 לאט יותר ב- ECS מאשר במדיום ללא חסימות 3 . עם זאת, הן α ו λ להשתנות עם גיל המוח, האזור, המדינה ובתנאים פתולוגיים 1 . שינויים של הפרמטרים הללו נקשרו להתפתחות המוח, הזדקנות, שינה, אפילפסיה, ותהליכים בסיסיים רבים אחרים ומחלות של המוח 1, 6 . בעוד טכניקות אחרות למדוד α ו λ , RTI יכול למדוד הן באזורים מקומיים של רקמה חיה בזמן אמת. מסיבה זו, RTI הפך לכלי הכרחי לבדיקת שינויים ב- α ו- λ במהלך אתגרים חריפים ובלתי הפיכים.
התיאוריה תומכת RTI אושרה במקור על ידי ניקולסון ו פיליפס, ואת הטכניקה שימשה בהרחבה מאז אותו 4 , 7 . ניסויים המעסיקים RTI להתחיל עם שחרורו של הדופק של TMA מן microelectrode מקור על ידי יונתורזה לתוך ג'ל agarose לדלל. לאחר נפלט, היונים בחופשיות להתפזר מן המקור נקודה, בחירה מתוך מספר אינסופי של נתיבים אקראיים ( איור 1 ד ). הריכוז המשתנה של יון נמדדת לאורך זמן באמצעות microelectrode יון סלקטיבית (ISM) מיקומו בגסות100 מיקרומטר משם ( איור 1 ג ). השינויים בריכוז TMA הם graphed ו מצויד עקומה המאפשר חישוב של D והן את מספר התחבורה של microelectrode יון (פרמטרים הנדונים בפרוטוקול). עם ערכים אלה, הנוהל חוזר על עצמו באזור במוח של עניין כדי לקבל D * ולחשב הן α ו λ . שליטה של microelectrode יון, איסוף נתונים, גרפים והתאמה של עקומת ריכוז TMA, וחישוב הפרמטרים הניסוייים נעשים בדרך כלל על ידי תוכניות וונדה וולטר, אשר תוכננו במיוחד למטרה זו (התוכנה המדריכים שלהם הם זמין באופן חופשי על ידי המחברים על פי בקשה).
סעיף הפרוטוקול של סקירה זו מתאר את ההליכים הבסיסיים הדרושים לתכנון וביצוע RTI בפרוסות מוח מכרסמים. הטכניקה יש גם נעשה שימוש ב-מוט לאמודלים אף אוזן גרון, כולל פרוסות מוח אנושיות ועל הכנות מוח vivo 1, 4, 6, 8, 9. החלק נציג תוצאות מספק הן אידיאליים ולא אידיאלי תוצאות להדגיש ניואנסים בפרשנות נתונים. לבסוף, סעיף הדיון מכסה בקצרה טכניקות לפתרון בעיות, מגבלות RTI, טכניקות חלופיות המשמשות ללימוד ECS, ויישומים עתידיים של RTI.
איור 1: דיאגרמות של דיפוזיה באמצעות ECS. ( א ) תרשים של ECS: מדגים את הגודל והמיקום של ECS בחלק מוחי טיפוסי. צהוב מסמן את ECS בין תהליכי תא המוח האפור. נפח ECS הוא בערך 20% מכלל נפח הרקמה ( כלומר, נפח השבר = 0.2) בתנאים פיזיולוגיים. ( ב ) תרשים מוגדל של ECS: מדגיש פרמטרים פיזיים התורמים טרטו, כולל גיאומטריה התא במוח (אפור) ו מטריקס תאיים (תרשים כמו רשת של glycosaminoglycans רבגוניים ו proteoglycans). ( ג ) תרשים 3D של דיפוזיה ממקור נקודה: מדגים את התנועה נטו של מולקולות אינרטי ממקור iontophoretic ל- ISM. לא כולל מחסומי דיפוזיה ספיגת הסלולר, מולקולות מפוזרות החוצה לכל הכיוונים, לייצר חזית ריכוז כדורית. ה- ISM מכמת את הריכוז המקומי של המולקולות האינרטיות המשתחררות מהמקור האונטופורטי. ( ד ) הדמיית מחשב של דיפוזיה ב ECS של המוח: [רחוק משמאל] ההתקנה עבור סימולציה מונטה קרלו; כדורים ירוקים מייצגים תהליכים בתאי המוח והצלב האדום מייצג מקור נקודה. הגדרה זו מודלים של רקמות המוח תרשים diagrammed באיור 1a . תמונה 36 מולקולות ביצוע תנועות אקראיות כפי שהם מפוזרים דרך החלל החוץ תאי של המוח, שמוצג 2 ממדים. [ימין קיצוני] מסלולים אקראיים של מולקולות רבות שוחררו ממקור הנקודה. התנועה נטו של כל המולקולות ממקור הנקודה היא כלפי חוץ כפי שמתואר באיור 1 ג . המסלולים האקראיים המצטברים מתארים את החללים שבין התאים ( כלומר, ECS, ראו התייחסות 5 להסבר נוסף). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Protocol
Representative Results
Discussion
איור 10: נתונים לא אידיאליים הממחישים בעיות טכניות נפוצות. ( א ) דיאגרמות של בעיות טכניות נפוצות עם microtlectrodes iontophoresis: השוואה של שחרור רגיל של TMA מ microelectrode iontophoresis תפקודית עם שלושה מקורות המפגינים בעיות ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה נתמכה על ידי NIH NINDS מענק R01 NS047557.
Materials
| A/D and D/A converter | National Instruments Corporation | NI USB-6221 DAQ | The NI USB-6221 is still sold as a 'Legacy' device by NI. They recommend using NI USB-6341 X Series DAQs for new installations, however we have not tested the newer units. We describe the use of the NI USB-6221 with MATLAB and Windows 7 (32-bit). Alternatives: the much older PCI-MIO-16E-4 A/D converter (Used under Windows XP or older OS only) with BNC-2090 BNC connector panel and SH68-68-EP cable. As noted in the Wanda Manual, an experimental MATLAB program to use Axon Binary Files is available. |
| agarose | Lonza | NuSieve GTG Agarose #50081 | to prepare dilute agarose gel for RTI measurements |
| amplifier for ISM | Dagan | Model IX2-700 Dual Intracellular Preamplifier | ion and reference voltage amplifier with N=0.1 (for reference barrel) and N=0.001 (for ion barrel) headstages |
| biological compound miscroscope (with 4x and 10x objective) | for chipping the microelectrode tips and inspecting microelectrodes; various suppliers, e.g. AmScope | ||
| borosilicate theta capillary glass tubing | Harvard Apparatus | Warner Instruments model TG200-4; order #64-0811 | double-barreled glass tubing for ion-selective microelectrodes and iontophoretic microelectrodes; O.D. 2.0 mm, I.D. 1.4 mm, septum 0.2 mm, length 10 cm |
| brush | Winsor & Newton | University Series 233, size 0 | round shoft handle brush, available from Amazon |
| bunsen burner | Fisher | ||
| camera for visualizing micropipettes | Olympus | OLY-150 | requires monitor, IR filter on substage illuminator is optional |
| chart recorder | to record continuously voltages on ion-selective microelectrode during calibration in tetramethylammonium standards and during RTI experiment; e.g. Kipp & Zonen type BD112 dual-cannel chart recorded, available refurbished | ||
| chlorotrimethylsilane, puriss., > 99% | Sigma-Aldrich | catalog # 92360 | for silanization; CAUTION: flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation), skin corrosion, eye damage, reacts violently with water, see Sigma-Aldrich Safety Information for full description |
| Commercial Software | The MathWorks | MATLAB, Data acquisition toolbox | for data acquisition and analysis using Wanda and Walter programs. Note that an academic license is available. |
| eye protective goggles | Fisher | ||
| fixed-stage compound microscope | Olympus | BX51WI | can use other compound microscopes with fixed stages |
| forceps | Fine Science Tools | #11251-10 | to chip glass capillary; Dumond #5, preferably used and no longer needed for fine work |
| fume hood | for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; various supliers, e.g. Captair with approriate filter sold by Erlab | ||
| glass microscope slide | Fisher | #12-550A | to chip microelectrode tips |
| heater/stirrer | Fisher | Corning PC-420D | to prepare dilute agarose gel and stir solutions |
| iontophoretic unit | Dagan | ION-100 and PS-100 | ION-100 is a single channel iontophoresis unit +/- 130 V compliance; PS-100 is an external power supply; alternatives: e.g. Axoprobe-1A made by Axon Instruments (now Molecular Devices), out of production, check for availability of refurbished units (eBay and other sites) |
| liquid ion exchanger (LIX) for tetramethylammonium | World Precision Instruments | IE190 Potassium Ion Exchanger | Note: this is equivalent to the original Corning potassium exchanger 477317 based on tetraphenlyborate – do not confuse with neutral carrier potassium exchanger originating from the laboartory of Dr. Simon, ETH, Zurich, which does not sense tetramethylammonium, and is sold by Fluka. You can also make liquid ion exchanger for tetramethylammonium yourself: 3% by weight potassium tetrakis = (p-chlorophenyl) borate dissolved in 2,3-dimethylnitrobenzene. Buy chemicals from Fluka (now part of Sigma). See Oehme and Simon (1976) Anal. Chim. Acta 86: 21-25; CAUTION: The toxicological properties of this liquid ion exchanger have not been fully determined. Ingestion or contact with the human body may be harmful. Exercise due care! Liquid ion exchangers should be stored in a cool place out of direct sunlight. |
| microelectrode holder | WPI | M3301EH | to hold ion-selective microeletrode prefabricate for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; WPI sells two versions of this holder, clear M3301EH and black M3301EH. In our experience, the clear M3301EH appears to be sturdier then the black M3301EH. |
| micromanipulator | Narishige | MM-3 | to position ion-selective microelectrode prefabricate during silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; can be substituted with any three-axis micromanipulator in good working condition |
| micropipette puller | Sutter Instruments | Model P-97 | to pull double-barreled glass tubing; other pullers can be used as long as they can accommodate large diameter double-barreled glass tubing |
| microprobe thermometer | Physiotemp | Model BAT-12R | fine probe of this thermometer is placed close to recording site |
| needle | BD | Syringes and Needles # 305122 (25 gauge) | for silanization; BD PrecisionGlide needles 25 G x 5/8 in (0.5mm x 16mm) |
| objective 5x dry | Olympus | MPlan N | |
| objective 10x water immersion | Olympus | UMPlan FL N | 10x objective is water immersion, numerical aperture is 0.3, working distance is 3.3 mm |
| plastic containers (with lids) | Fisher | #14-375-148 | to store tetramethylammonium standard solutions and microelectrodes |
| platform and x-y translation stage for fixed-stage microscope | EXFO | Gibraltar Burleigh | platform holds slice chamber, micromanipulators and accesorries, x-y translational stage moves microscope without compromising recording stability |
| porous minicup | for RTI measurements in a dilute agarose gel; homemade | ||
| reusable adhesive | Bostik | Blu-Tack | for securing microelectrodes to holding vessel and other uses; various suppliers, available from Amazon |
| robotic micromanipulator with precise x,y,z positioning | Sutter Instruments | MP-285 | two mircomanipulators are needed to hold separately ion-selective microelectrode and iontophoretic microelectrode. Also possible to glue micropipettes in a spaced array (see text). |
| signal conditioning unit with low-pass filter | Axon Instruments | CyberAmp 320 or 380 | no longer available from the manufacturer but may be available from E-Bay; alternatives: e.g. FLA-01 Filter/Amplifier from Cygnus Technology. This is a single channel instrument with a minimum cutoff at 10 Hz using a multipole Bessel filter but the company may be willing to modify it for a lower cutoff frequency (2 Hz) if needed. |
| silver wire | A-M Systems | #7830 | diameter 0.015", bare (no coating) |
| slice chamber | Harvard Apparatus | Warner Model RC-27L | this is submersion slice chamber; do not use interface slice chamber |
| stereomicroscope | for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; horizontally mounted; various suppliers | ||
| syringe, 10 mL | BD | Syringes and Needles #309604 | to backfill microelectrodes and for silanization; BD Luer-Lok tip |
| syringe filter 0.22µm pore | Whatman | #6780-1302 | to filter backfill solutions; available from Fisher |
| syringe needle, 28 gauge, 97mm | World Precision Instruments | MicroFil MF28G-5 | to backfill microelectrodes |
| Teflon (=PTFE) tubing | Component Supply | STT-28 PTFE tube light wall (28 gauge) | for silanization of ion-selective barrel; fits on BD PrecisionGlide needles 25 G x 5/8 in. Note: Teflon is essential, PVC tubing would melt by hot wax. |
| temperature control system | Harvard Apparatus | Warner Models TC-344B and SH-27A | TC-344B is a dual automatic temperature controller, SH-27A is an in-line heater; controller and heater work with Warner slice chambers |
| tetramethyammonium (TMA) chloride | Sigma-Aldrich | T-3411 | 5 M solution; CAUTION: acute toxicity (oral, dermal, inhalation), carcinogenicity, hazardous to the aquatic environment, see Sigma-Aldrich Safety Information for full description |
| vibrating blade microtome | Leica | VT1000S | to cut brain slices |
| xylenes | Fisher | X5-1 | for silanization; CAUTION: flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation), skin corrosion, eye damage, carcinogenicity, see Fisher Safety Information for full description |
References
- Sykova, E., Nicholson, C. Diffusion in brain extracellular space. Physiol Rev. 88 (4), 1277-1340 (2008).
- Nicholson, C. Diffusion and related transport mechanisms in brain tissue. Rep Prog Phys. 64 (7), 815-884 (2001).
- Nicholson, C. Ion-selective microelectrodes and diffusion measurements as tools to explore the brain cell microenvironment. J Neurosci Methods. 48 (3), 199-213 (1993).
- Nicholson, C., Phillips, J. M. Ion diffusion modified by tortuosity and volume fraction in the extracellular microenvironment of the rat cerebellum. J Physiol. 321, 225-257 (1981).
- Nicholson, C., Sykova, E. Extracellular space structure revealed by diffusion analysis. Trends Neurosci. 21 (5), 207-215 (1998).
- Xie, L. L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342 (6156), 373-377 (2013).
- Hrabetova, S., Nicholson, C., Michael, A. C., Borland, L. M. Biophysical properties of brain extracellular space explored with ion-selective microelectrodes, integrative optical imaging and related techniques. Electrochemical Methods for Neuroscience Neuroscience. , 167-204 (2007).
- Rice, M. E., Okada, Y. C., Nicholson, C. Anisotropic and heterogeneous diffusion in the turtle cerebellum: implications for volume transmission. J Neurophysiol. 70 (5), 2035-2044 (1993).
- Vargova, L., et al. Diffusion parameters of the extracellular space in human gliomas. Glia. 42 (1), 77-88 (2003).
- Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. Double-barreled and concentric microelectrodes for measurement of extracellular ion signals in brain tissue. J Vis Exp. (103), (2015).
- Xiao, F., Hrabetova, S. Enlarged extracellular space of aquaporin-4-deficient mice does not enhance diffusion of Alexa Fluor 488 or dextran polymers. Neurosciences. 161 (1), 39-45 (2009).
- Sherpa, A. D., Pvan de Nes, ., Xiao, F., Weedon, J., Hrabetova, S. Gliotoxin-induced swelling of astrocytes hinders diffusion in brain extracellular space via formation of dead-space microdomains. Glia. 62 (7), 1053-1065 (2014).
- Kume-Kick, J., et al. Independence of extracellular tortuosity and volume fraction during osmotic challenge in rat neocortex. J Physiol. 542 (Pt 2), 515-527 (2002).
- Saghyan, A., Lewis, D. P., Hrabe, J., Hrabetova, S. Extracellular diffusion in laminar brain structures exemplified by hippocampus. J Neurosci Methods. 205 (1), 110-118 (2012).
- Fedirko, N., Svichar, N., Chesler, M. Fabrication and use of high-speed, concentric H+- and Ca2+-selective microelectrodes suitable for in vitro extracellular recording. J Neurophys. 96 (2), 919-924 (2006).
- Nicholson, C. Diffusion from an injected volume of a substance in brain tissue with arbitrary volume fraction and tortuosity. Brain Res. 333 (2), 325-329 (1985).
- Nicholson, C., Tao, L. Hindered diffusion of high molecular weight compounds in brain extracellular microenvironment measured with integrative optical imaging. Biophys J. 65 (6), 2277-2290 (1993).
- Thorne, R. G., Nicholson, C. In vivo diffusion analysis with quantum dots and dextrans predicts the width of brain extracellular space. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (14), 5567-5572 (2006).
- Wolak, D. J., Thorne, R. G. Diffusion of macromolecules in the brain: implications for drug delivery. Mol Pharm. 10 (5), 1492-1504 (2013).
