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Biologie

학부 교육 연구소에 대 한 효 모 에스트로겐 화면 최적화를 사용 하는 퍼스널 케어 제품에서 Estrogenic Ligands를 검출

Published: January 01, 2018
doi:
10.3791/55754
, , , , ,
1Department of Biology,University of the South, 2School of Biological Sciences,Louisiana Tech University, 3School of Medicine,Louisiana State University Health Sciences Center, 4Department of Biology,Furman University, 5Department of Computer Science,Louisiana Tech University, 6Clemson University

Summary

이 문서는 퍼스널 케어 제품 (Pcp) 에스트로겐 수용 체 알파 (ERα) 또는 베타 (ERβ)를 결속 하는 ligands를 측정에 대 한 최적화 된 효 모 에스트로겐 화면을 표시 합니다. 메서드는 두 색도계 기판 옵션, 학부 과정에서 사용 하기 위해 6 일 냉장된 인큐베이션 및 데이터 분석을 위한 통계 도구를 통합합니다.

Abstract

효 모 에스트로겐 화면 (예) 환경 샘플에서 estrogenic ligands를 검출 하는 데 사용 하 고 내 분 비 장애의 연구에 광범위 하 게 적용 되었습니다. Estrogenic ligands는 자연적이 고 인공 “환경 에스트로겐” (EEs) 퍼스널 케어 제품 (Pcp), 플라스틱, 농약, 및 식품을 포함 한 많은 소비자 제품에서 발견 포함 되어 있습니다. EEs는 인간과 다른 동물에서 신호, 잠재적으로 비 옥을 감소 하 고 질병 위험 증가 호르몬을 방해. EEs 및 기타 내 분 비 방해 화학 물질 (EDCs) 공중 보건의 중요성에도 불구 하 고 내 분 비 장애 일반적으로 학부 교육 과정에 포함 되지 않습니다. 이 결점은 또한 학부 학생 들에 게 접근할 수 있으면서도 참여 원칙을 설명 하는 관련 실험실 활동의 부족 때문에 부분적으로. 이 문서를 에스트로겐 수용 체 알파 (ERα) 또는 베타 (ERβ) 퍼스널 케어 제품에 ligands를 측정에 대 한 예는 최적화 된 제공 합니다. 메서드가 두 색도계 기판 중 통합 (ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) 또는 chlorophenol 레드-β-D-galactopyranoside (CPRG))는 β-galactosidase에 의해 죽 습, 6 일 냉장된 인큐베이션 단계 LacZ 계산과 관련된 4-매개 변수 로지스틱 회귀 분석에 대 한 R 코드에 대 한 학부 실험실 과정, 자동화 된 응용 프로그램에서 사용을 촉진 한다. 프로토콜 개발 하 고 있는 그들은 제품의 에스트로겐 모방에 대 한 그들의 선택의 화면 실험 학부생 수 있도록 설계 되었습니다. 이 과정에서 그들은 내 분 비 장애, 세포 배양, 수용 체 바인딩, 효소 활동, 유전 공학, 통계, 그리고 실험 설계에 대해 알아보십시오. 동시에, 그들은 또한 근본적이 고 광범위 하 게 적용 가능한 실험실 기술을 연습와 같은: 계산 농도; 만드는 솔루션; 시연 메 마른 기술; 직렬 diluting 표준; 구성 하 고 표준 곡선; 보간 식별 하는 변수 및 컨트롤; 수집, 조직, 및 데이터 분석 구성 하 고 해석 그래프; 그리고 micropipettors, 광 등 일반적인 실험실 장비를 사용 하 여. 따라서,이 분석 결과 구현 기반 학습 환경 과학 및 건강에 새로운 문제를 탐험 하는 동안에 종사 하는 학생 들을 장려 한다.

Introduction

효 모 에스트로겐 화면 (예)는 estradiol (e 2 또는 17β-estradiol) 행렬, 물, 식물 조직, 소비자 제품 및 식품1,2,3,를 포함 하 여 다양 한 모방 ligands를 계량에 널리 사용 됩니다. 4. 샨 다, 이러한 ligands “환경 에스트로겐 (EEs).” 라고 예는 낮은 비용, 대안 생체 외에서 vivo에서 테스트 같은 설치류 uterotrophic5,6 분석 결과 및 분석 결과7먹이 무지개 송어로 원래 개발 되었다. 이 테스트의 목표는 제품 포함 자극 또는 에스트로겐-종속 메커니즘을 차단 하는 화학 물질 결정 하는. EEs의 탐지는 중요 한, 그들은 신호, 태아의 개발 중 특히 정상적인 내 인 성 에스트로겐을 방해할 수 있습니다 때문입니다. 이 방해는 비만, 불 임, 암, 그리고 인지 손실8의 위험을 증가 시켜 건강을 타협.

EEs 및 다른 EDCs 공중 보건의 중요성에도 불구 하 고 내 분 비 장애 일반적으로 학부 교육 과정에 포함 되지 않습니다. 이 부족은 또한 학부 학생 들에 게 접근할 수 있는 동안 참여 원칙을 설명 하는 활동의 부족 때문에 부분적으로 이다. 또한, 예 프로토콜의 여러 변형이 존재9,10,11,,1213, 그리고이 다양성은 분석 결과 최적화에 대 한 시간이 실험실 코디네이터는 명확 하 게 관련 기술에서 훈련. 마지막으로, 네 분석 실험은 일반적으로 이상의 1 긴 하루 또는 완료 O/N 외피와 함께 2 일 연속. 이 타이밍은 일반적으로 한 번만 나 학부 실험실 과정의 형식으로 호환 되지 않습니다 / 몇 시간 주.

이러한 요구에 대응,이 원고는 개인 배려 제품 (Pcp)3 , 매주 실험실 회의 수용 하기 위해 6 일 냉장 단계에 대 한 ethanolic 추출 방법을 포함 하는 최적화 된 96 잘 예 프로토콜을 보고 합니다. 절대 에탄올은 다양 한 극 지와 비 극성 용액을 해산 할 수 있는 다양 한 유기 용 매 이다. 또한, 그것은 학부 과정에 적합 하기 때문에 그것은 쉽게 사용할 수, 상대적으로 비 독성, 저렴 한, 혼합할 수 있는 물; 그것은 또한 특별 한 장비 없이 쉽게 증발. 그러나, 에탄올 강하게 소수 성 내 분 비 분리기 또는 많은 오일과 왁 스를 추출 하기 위한 이상적인, Pcp. 가난한 추출 효율에 일반적인 재료 되 고 후자의 두 틀린 부정적인 결과의 모험을 증가 한다. 마음에이 제약 조사 그 주소 샘플 특성 추출 절차 (예를 들어, ethanolic 추출 또는 고체 상 추출)를 선택 하 고 연구 목적 (연구 학부 교육 대)을 충족 해야 합니다.

예는 재조합 Saccharomyces cerevisiae 원래 Tulane 대학에서 박사 찰스 밀러에 의해 만들어진에 의존 합니다. 밀러 그 외 여러분 보십시오 (2010 년) 엔지니어링된 플라스 미드14의 완전 한 지도 위해. 익스프레스 인간의 핵 ERα 또는 ERβ (또한 부르는 ESR1 그리고 ESR2, 각각) 효 모 constitutively이 플라스 미드와 변형 (ERα)에 대 한 갈 락 토스 또는 포도 당 또는 갈 락 토스 (ERβ)에 대 한 포함 된 미디어에 성장 될 때. Estrogenic 화학 미디어에 있다면, 그들은 β-galactosidase (lacZ) 식 estrogenic 화학 물질의 농도에 비례 하는 수준을 활성화 하는 리간드-수용 체 복합물을 만드는 수용 체에 바인딩합니다. 효 모 세포는 다음 출시 축적 된 β-galactosidase lysed. 세포의 용 해 버퍼는 ONPG 또는 CPRG, β-galactosidase 노란색 또는 빨간색 제품을 각각 산출 하 여 죽 습 포함 되어 있습니다. 색도계 제품 microwell 플레이트 분 광 광도 계를 사용 하 여 흡 광도 측정 하 여 측정할 수 있습니다. 색상 변경의 정도 누 룩 노출 되었다 estrogenic ligands의 농도에 비례.

테스트 중인 샘플에서 발생 하는 배경 흡 광도 대 한 잠재력에 따라 기판 (CPRG 또는 ONPG) 선택 합니다. 예를 들어 식물 추출 됩니다 추가 하기도 노란색 색조 미디어 경우 인위적으로 estrogenicity 측정을 웃 기는 ONPG (405에서 계량 nm) β-galactosidase는 기판으로 사용 됩니다. 와 식물 추출 물, CPRG (574에 계량 nm) 더 적절 한 색도계 기판 있을 수 있습니다. CPRG는 ONPG 보다 더 비싼 하지만 10 분의 1 몰에 사용 됩니다. 이 문서는 주치의의 estrogenicities ONPG와 CPRG를 사용 하 여 정량 추출 물을 선물 한다.

ERα 및 ERβ를 사용 하 여 환경 샘플의 estrogenicity를 측정 이러한 수용 체 중 하나만 사용 하 여 보다 더 포괄적인 접근 이다. 동물,이 수용 체 차동 조직 배포, 규제 활동, 및 바인딩 선호도 estrogenic 안티 estrogenic ligands15전시. 예를 들어 식물 기반 에스트로겐 일반적으로 바인딩할 ERβ 더 강력 하 게2, 합성 화학 물질 중 ERα 또는 ERβ에 대 한 선호를 표시할 수 있습니다 또는 두 수용 체 똑같이 잘15를 바인딩할 수 있습니다. 따라서, 한 에스트로겐 수용 체에 바인딩은 반드시 다른 바인딩을 예언 하지 않습니다.

EEs는 식물 뿐만 아니라 많은 소비자 제품 (예, 농약, 세제, 접착제, 윤활제, 플라스틱, 식품 및 의약품)에서 발견, 제시 데이터 Pcp. 선택을 사용 하 여 가져온 Pcp는 경쟁력, 쉽게 사용할 수 있는, 예산 친화적인, 그리고 학부생을 위한 환경 관련. 학생 가정 실험실에서 테스트에서 그들의 좋아하는 Pcp를가지고 초대 될 수 있습니다. 그들은 또한 높은 Pcp의 가설 기반 비교를 생성 하 여 독성 점수 낮은 환경 실무 그룹16 에 의해 개발 된 피부 깊은 데이터베이스를 검색할 수 있습니다. 이 방법에서는, 학생 들은 동시에 고급 실험실 능력; 개발할 수 있습니다. 자율, 기반 학습;에 관여 환경 과학 및 건강에 새로운 문제를 탐구 하 고.

Protocol

1. 시 약 6.7 g 효 모 질소 기본, 20 g 포도 당 또는 갈 락 토스, 20mg 아데닌 황산 (추가 200 mg/100 mL 재고 용액 10 mL), 20 mg uracil (추가 200 mg/100 mL 재고 용액 10 mL) 혼합 하 여 포도 당 그리고 갈 락 토스 미디어 준비 60 mg 신 (1 g/100 mL 수성 재고 솔루션의 6 mL 추가), 그리고 이온 물 여과 (0.2 µ m 필터)에 의해 1 L. Sterilize의 마지막 볼륨에 20mg 히스티딘 (추가 1 g/100 mL 수성 재고 솔루션의 2 개 mL). 몇 주 동안 4 ° C에서 미디어를 저장할 수 있습니다. Estradiol (e 2) 표준 녹이는 가루 E2 무수 에탄올에 적절 한 작동 농도를 희석 하 여 준비 (227.5 nM & 9.75 nM) 50% 에탄올에.참고: estradiol 1mg의 유리병으로 구입한 경우 해산 estradiol 분말 유리병에 직접 1 mL 에탄올을 추가 합니다. 이 3.67 m m 재고 # 1을 생성합니다.  주식의 36.71 μ M #2 1 mL을 990 μ 에탄올에 #1 주식의 10 μ 희석.  그런 다음 희석 367.13 nM 주식 # 3의 1 mL을 990 μ 50% 에탄올에 #2 주식의 10 μ.  작업 주식을 하려면 619.7 μ 주식 #3 227.5 nM 일 주식 ERα을 표현 하는 효 모와 표준 곡선을 만드는 데 사용의 1 mL를 만들려고 380.3 μ 50% 에탄올을 희석.  26.56 μ 주식 #3 1 mL의 9.75 nM 작업 ERβ을 표현 하는 효 모와 표준 곡선을 작성 하는 데 사용 하도록 973.44 μ 50% 에탄올을 희석. 표준 parafilm와-20에 게 인감 또는-70 ° C주의: e 2는 발암 의심된 물질 및 생식 toxicant. 그것은 흡입, 삼 켜, 또는 피부를 통해 흡수 하는 경우에 유해한입니다. E2 모유 어린이 태아에 해를 일으킬 수 있습니다. E2 수생 생활에 매우 독성이 있다. 적절 한 개인 보호 (장갑, 연기 후드, 먼지 마스크)을 사용 하 고 임신과 수 유 동안 노출을 피하십시오. 유해 폐기물으로 e 2를 처분 하 고 환경에 공개 하지 마십시오. 마지막에 이온된 수에 8.52 g Na2HPO4, 5.52 g NaH2포4•H2O, 95.21 mg MgCl2, 745.5 mg KCl, 2 세대 N-lauroylsarcosine 나트륨 소금, ONPG (400 mg) 및 CPRG (77.7 m g)를 혼합 하 여 LacZ 버퍼를 준비 -20 ° c.에 20 mL aliquots에 1 나 저장소 LacZ 버퍼의 볼륨참고: 20 mL aliquot는 충분 한 96 잘 접시입니다. 105.9 g 1 나 게 실시간의 최종 볼륨을 이온된 수에 탄산 나트륨을 혼합 하 여 탄산 나트륨을 준비 준비 물에서 1 M dithiothreitol (DTT). -20 ° c.에 DTT의 25 µ L aliquots 고정주의: DTT는 급성 피부 및 눈 자극. 적절 한 개인 보호 장비 (장갑, 연기 후드, 먼지 마스크)를 사용 하 여 피부와 눈 접촉, 흡입 및 섭취를 피하기 위해.참고: 각 약 수 한 96 잘 접시 충분 하다. 2. 샘플 및 추출 컨트롤 준비 샘플 테스트를 선택 합니다.참고:이 문서 15 Pcp, 비누, 헤어 크림, 샴푸, 선스크린, 립밤, 재단, 면도 크림, 매니큐어, 그리고 로션을 포함 하 여에 대 한 데이터를 제공 합니다. 15 mL 원뿔 튜브에 무수 에탄올 10 mL에 1 g 샘플의 결합. 15 mL 원뿔 튜브에서 에탄올의 11 mL의 구성 된 부정적인 추출 제어를 준비 합니다. 필요에 따라 복제를 준비 합니다.참고: 제시 실험 설계에 대 한 모든 15 Pcp 및 triplicate 추출 제어 솔루션의 3 aliquots 준비 되었다, 저조한 총 48 샘플, 각각의 섹션 4에에서는 프로토콜을 사용 하 여 3 중에서 분석 했다. 단일 플레이트 triplicates에서 최대 23 샘플을 수용할 수 있습니다. 무수 에탄올은 쉽게 증발 하기 때문에이 단계에서 사용 됩니다. 부정적인 추출 제어를 사용 하 여 에스트로겐 원뿔 튜브에서 샘플에 leaching 하지는 확인. 수동 진동 및 vortexing의 조합에 의해 또는 다중 튜브 vortexer에 튜브를 떨고 하 여 30 분 동안 튜브 내용을 균질. 원심 10 분 Decant 대 양동이 분리기에 최대 허용 속도에 원뿔 튜브 각 튜브에서 상쾌한 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 50 mL 원뿔 관으로. 유리 섬광 유리병으로 각 50 mL 튜브의 빈 내용입니다. 두고 튜브 에탄올을 완전히 증발 수 있도록 1 주일에 대 한 환기 후드에서 엽니다. 또는, 통풍된 후드 또는 회전 증발 기 질소 아래에 샘플을 건조. 빛 민감한 성분의 저하를 방지 하려면 (예를 들어, 통풍된 후드 문에 장소 불투명 원단) 빛에서 건조 샘플을 보호 합니다. 50% 에탄올과 균질에 소용돌이의 1.0 ml 샘플 reconstitute 3. 배양 및 효 모14 Subculturing 30 ° c.에 필터 살 균 포도 당 미디어에서 효 모 배양에 의해 활성 효 모 문화 ( S. cerevisiae14의 재조합 W303a 변형)을 유지 신선한 필터 살 균 포도 당 미디어에서 매주 효 subculture 2 박 (약 42 시간) 예 판 준비 전에 subculture 무 균 기술을 사용 하 여 필터 살 균 포도 당 미디어의 10 mL를 활성 효 모 문화의 0.1 mL를 추가 하 여 효 모.  이틀 동안 30 ° C에서 품 어.  만약 효 모는 성장 얕은 문화로 살 균 250 ml 삼각 플라스 크를 흔들어 필요 하지 않습니다.참고: 효 모도 저장할 수 있습니다 냉장된 한 판에 몇 달 동안. 장기 저장을 위해 (년), O/N 문화 15-50% 메 마른 글리세롤, 소용돌이, 및 결합-70 ° c.에 동결 살 균 글리세롤을 준비 하려면 주사기를 사용 하 여 느슨하게 모자 cryovial 고 압력솥에 300 µ L 글리세롤을 전송. 그럼 1200 µ L O/N 효 모 문화 무 균 기술을 사용 하 여 추가 합니다. 4. 준비 예 판 (분석 결과 1 일) 살 균 비 커, 무 균 기술을 사용 하 여 희석 610에서 0.065 0.005의 광학 밀도 단계 3.2에서에서 효 모 살 균 하는 필터 갈 락 토스 미디어에 nm (OD610). 명확한 폴리스 티 렌 격판덮개로 각 효 모 샘플 triplicate 갈 락 토스 공백 함께 3 중에 pipetting 120 μ에 의해 광학 밀도 확인 (접시 필요가 없습니다 살 균 수).  플레이트 분 광 광도 계를 사용 하 여 희석된 효 모 문화 누 룩의 net OD610 를 결정 하기 위해 효 모 OD610 독서에서 갈 락 토스의 0.065 0.005 빼기 OD610 판독의 net OD610 있는지 확인 합니다. 각 96 잘 접시 적어도 30 mL 희석 효의 최종 볼륨을 준비 합니다.참고: 595 610 nm 사이의 흡 광도 측정 하는 분 광 광도 계 필터는이 측정을 위해 사용할 수 있습니다.대략 1:6 v: 비 효 모: 미디어의 일반적으로 수익률 0.065 가까이 OD610 , 그래서 30 mL 미디어 4.5 mL 누 룩을 추가 하 여 시작 하 고 netOD610 0.060 0.070 사이 달성 하기 위해 적절 한으로 더 많은 효 모 또는 미디어를 추가. 무 균 기술을 사용 하 여, 웰 스는 살 균의 폴 리 프로필 렌, 96-잘 microplate 접시 레이아웃 (그림 1)에 따라 희석된 효 모 현 탁 액이 추가 합니다. Pipetting, 동안 유지 소스 지속적으로 컨테이너 소용돌이 또는 피펫으로 혼합에 의해 중단 하는 효 모. 이 단계에 대 한 멸 균 주사기 팁 반복 pipettor를 사용 하 여 도움이 됩니다.참고: 폴 리 프로필 렌 플레이트 압력가 마로 소독 두 누적된 판 호 일에 포장 하 여 멸 균.  상단 플레이트 샘플 접시 뚜껑 역할 수 세척, 다시 압력가 하는, 그리고 다시. 3 추가 웰 스 (h 10-12) 플레이트 레이아웃 (그림 1)에 따라 120 µ L 필터 소독 갈 락 토스 미디어를 추가 합니다. 이러한 우물 혼자 미디어에 의해 공헌 하는 흡 광도을 미디어 컨트롤 역할을 합니다. 직렬로 e 2 작업 표준의 triplicates를 diluting 하 여 각 접시에 표준 곡선을 생성 (227.5 nM ERα, 9.75에 대 한 ERβ에 대 한 nM) 효 모 현 탁 액 (A1-g 3은) 격판덮개 레이아웃 (그림 1)에 따라 포함 하는 우물에.  웰 스 A1 a 3 통해 E2 표준의 5 µ L을 추가 하 여 먼저. Pipetting, microwell 내용을 혼합 하 고 순차적으로 우물 A1-B1-3 웰 스에 3에서에서 205 µ L를 이동 하 여이 현 탁이 액을 희석. 혼합 및 행 G. 통해 205 µ L의 이전 반복참고: 직렬 희석 완료 되 면 우물 g 1-3에서에서 205 μ를 삭제 합니다. 이 단계의 끝에, 모든 표준 웰 스 120 μ를 포함 해야 합니다. 직렬 희석 표 1에 나열 된 마지막 E2 농도 얻을 것입니다. 직렬 희석 단계에 대 한 멸 균 팁 멀티 채널 pipettor를 사용 하 여 도움이 됩니다. 차량 제어 웰 스 효 모 현 탁 액 (h 1-3) 접시 레이아웃 (그림 1)에 따라 포함 된 차량 (50% 에탄올)의 5 µ L를 추가 합니다.참고: 차량 제어 웰 스는 효 모 세포 및 미디어와 관련 된 배경 흡 광도 측정 하는 데 사용 됩니다. 또한, 테스트 샘플의 OD610 값을 비교 하 여 검출 될 수 있다 세포 독성 또는 성장 촉진 효과와 차량 제어 우물의 우물을 테스트 합니다. 플레이트 레이아웃 (그림 1)에 따라 효 모 현 탁 액을 포함 하는 웰 스에 샘플 및 부정적인 추출 컨트롤의 5 µ L triplicates를 추가 합니다.참고: 기록해 샘플 또는 부정적인 추출 컨트롤이 추가 되는 각 음에.  추적 하는 웰 스 샘플 하 고는 하지 않는, 팁의 신선한 상자와 함께 시작 하 고 접시에 해당 우물의 위치와 상자에 동일한 위치에서 도움말을 사용 하 여 있다. 한 96 잘 접시는 3 중에서 최대 23 샘플을 수용할 수 있습니다. Pipetting으로 샘플, 추출 제어, 그리고 차량 제어 웰 스의 내용을 혼합. 그림 1에 대 한 범례에 설명 된 대로 각 205 µ L을 제거 하 여 120 µ L에이 우물의 볼륨을 조정 합니다. 살 균, 접착제, 다공성 필름으로 plate(s) 인감. 접시를 레이블 및 17 h 30 ° c.에 대 한 품 어 접시 외피 동안 흔들릴 필요는 없습니다. 5. 처리 예 판 (분석 결과의 주 2) 30 ° C에서 17 h 부 화 후 인큐베이터에서 플레이트를 제거 합니다. 접시는 즉시에서 처리 될 것입니다, 5.1.1 단계로 진행 합니다. 접시는 나중에 처리 됩니다, 5.1.2 단계로 진행 합니다. 멀티 채널 pipettor 우물, 각 행의 내용을 믹스를 사용 하 여 그리고 명확 하 고, 폴리스 티 렌, 96-잘 microplate의 해당 각 우물에서 효 모 현 탁 액의 50 µ L을 전송.참고: 폴리스 티 렌 접시 살 균 될 필요가 없습니다 하지만 뚜껑이 있어야 한다. 사용 하 여 새로운 피펫으로 팁 웰 스의 각 행에 대 한 교차 오염 우물을 피하기 위해 팁만 triplicate 세트 사이 변경 해야 8 팁 멀티 채널 피 펫과 triplicates에 걸쳐 pipetting, 경우. 새로운 플레이트를 레이블을 지정 합니다. 5.2 단계로 진행 합니다. 저장 처리 하기 전에 격판덮개, 플라스틱 랩에 포장. 6 4 ° C에서 래핑된 플레이트를 냉장 디 그 후, 냉장고에서 플레이트를 제거, 그들 풀 다 그리고 단계 5.1.1 에서처럼 pipetting에 의해 모든 우물의 내용을 전송. 5.2 단계로 진행 합니다. 1mm DTT의 최종 농도 대 한 해 동된, 실내 온도 LacZ 버퍼의 20 mL를 1 M DTT의 20 µ L를 추가 합니다. 잘 믹스 LacZ 버퍼입니다. 다중 채널 피 펫을 사용 하는 경우 시 약 저수지로 분배.주의: 장갑을 착용 하 고 가능한 경우 후드, DTT와 함께 작동 어느 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 또는 pipettor 반복, 폴리스 티 렌 판 모든 우물에 DTT ONPG 및 CPRG를 포함 하는 LacZ 버퍼의 200 µ L을 추가 하 고 측정 한 즉시 플레이트 분 광 광도 계를 사용 하 여 모든 우물의 OD610 기록. 추가 번호판에 대 한 필요에 따라 반복 합니다.참고: OD610 판독 LacZ 계산 (단계 6.1)의 분모에 사용 됩니다. 이러한 이유로, 읽기 pipetting 직후와 셀 정착 하기 전에 얻거나 LacZ 버퍼에 의해 lysed. OD610 값 샘플 웰 스에 대 한 눈에 띄게 높거나 차량 제어 웰 스에 대 한 OD610 값 보다 낮은 경우, 샘플 추출은 성장 촉진 또는 효 모 세포 독성 각각. 계산 셀 밀도 작은 차이 웰 스, 하지만 차이가 어느 방향으로 30%를 초과할 경우 전체 수정 것 이다 LacZ 추가 50% 에탄올에 (단계 2.6)에서 재구성된 샘플 희석 그리고 3.2 단계로 반환 하 여이 샘플을 다시 테스트 12. 커버 뚜껑 접시. 그 표현 ERα14 30 ° C (ONPG)에 대 일 분 또는 3 h (CPRG)에 대 한 효 모에 포함 된 접시를 품 어. 그 표현 ERβ14 30 ° C (ONPG)에 대 일 분 또는 4 h (CPRG)에 대 한 효 모에 포함 된 접시를 품 어.참고: CPRG를 사용할 경우 보육 시간 있습니다 유연; 잠복기 2-4 h에 대 한 분석 결과 감도 증가 하는 더 이상 외피와 두 수용 체와 적당 한 결과 생성 합니다. 플레이트 잠복기 후 각 우물에 탄산 나트륨의 100 µ L을 추가 하는 멀티 채널 피 펫 또는 반복 pipettor을 사용 합니다. 탄산 나트륨 pH를 제기 하 고 β-galactosidase 반응 중지. 측정 하 고 OD405 (ONPG)에 대 한 또는 플레이트 분 광 광도 계를 사용 하 여 모든 우물 (CPRG)에 대 한 OD574 기록. 6입니다.LacZ 값 계산 참고: LacZ 값 각 샘플에 대 한 색상 변경의 정도 계량 하 고 제공 하는 몇 가지 변수를 고려 하 여 별도 분석 실험 간의 값을 비교 하는 정규화 된 방법 (예, 효 모 광 밀도, 미디어 광 밀도, 그리고 보육 시간 이 같은 접시에 우물 마다 다릅니다)12. 미디어 (갈 락 토스) 제어 웰 스 (h 10-12), triplicate OD610 값의 의미를 계산 하 고 계산 triplicate OD405 또는 차량 (50% 에탄올) 컨트롤 (h 1-3)에 대 한 OD574 값의 의미. 사용 하 여 이러한 의미와 부 화 시간 (t) 접시에 대 한 시간에 색상 (단계 5.5) LacZ 값 (각 잘에서 색상 변경의 정도 해당) 계산을 변경 모든 표준에 대 한 및 샘플 우물 다음과 같은 방정식을 사용 하 여: 또는 LacZ 표준 및 샘플에 대 한 값을 계산할 부록 1 에서 자동된 응용 프로그램을 사용 합니다.참고: 응용 프로그램 함께 사용 하는 접시 레이아웃 동일 접시 레이아웃 그림 1에 제시 해야 합니다. 일부 샘플 우물 사용 되지 않은 경우 빈 우물에서 흡 광도 신호는 부록 1 LacZ 응용 프로그램에 붙여넣을 흡 광도 데이터 집합에서 자리 표시자로 유지 됩니다.  이 응용 프로그램에서 접시의 공간 레이아웃을 유지 하 고 그들의 원하는 위치에 미디어 컨트롤 웰 스는 되도록 합니다.  또한, 빈 셀이 응용 프로그램이 실행 되지 않습니다. 각 샘플에 대 한 각 E2 표준 triplicate LacZ 값의 의미를 계산 합니다. LacZ 평균값 µ L-1으로 보고 h-1. 로그 변환 표준, 각 E2의 농도 그리고 template.csv 파일 (부록 2)에서 같이 형식의 스프레드시트 문서를 생성. 7. 샘플 Estradiol 등가물 (EEQs) 4-매개 변수 로지스틱 회귀를 사용 하 여 보간 참고: EEQs e 2를 사용 하 여 만든 표준 곡선의 LacZ 값 샘플 LacZ 값 (색상 변경) 관계. EEQs는 따라서 얼마나 많은 샘플은 e 2의 알려진 농도 같은 색상 변경 응답을 유도 하는 데 필요한 결정 합니다. EEQs 테스트 샘플을 계산 하려면 먼저 표준 곡선을 플롯. E2 표준 (y 축) 및 해당 로그 변환 E2 농도 (x 축) 4-매개 변수 로지스틱 회귀 모델에 대 한 평균 LacZ 값에 맞게. 테스트 샘플 LacZ 값 EEQs을 보간 하는 모델을 사용 합니다. 부록 2에 설명 된 대로 통계 소프트웨어를 사용 하 여 EEQs의 로지스틱 회귀 계산을 수행 합니다. 8. 표준화 주치의 샘플 질량에 EEQs (ng/mL) EEQs 주치의 샘플에 추가 금액에 관련 된 각 단계 4.5에서에서 잘, 증식 EEQ (ng/mL) 샘플 웰 스 (325 µ L)으로 도금 총 볼륨 그리고 다음 추출된 샘플 추가 볼륨을 나누어 각 음 (5 µ L)에.참고:이 값은 추출 된 샘플의 mL 당 EEQ를 나타냅니다. 주치의의 1 g를 사용 하 여 샘플 준비, 이러한 값 그램 주치의 (ng/g) 당 EEQ를 또한 나타냅니다. 이 방식으로 표현, EEQ 값 (ng/g) 비교 될 수 있다 다른 Pcp. EEQ (ng/g) 값이 연구에서 테스트 하는 퍼스널 케어 제품 표 2에 표시 됩니다 및 전체 프로토콜에 걸쳐 수집 된 샘플 데이터는 에 포함 되어 있습니다. 부록 3.

Representative Results

15 Pcp의 triplicate 샘플의 estrogenicities이 예 프로토콜을 사용 하 여 평가 되었다. 밀러 그 외 여러분 에 의해 설명 했 듯이 (2010 년), ERβ을 표현 하는 효 모와 분석 ERα (그림 2)14를 표현 하는 효 모와 분석 보다 더 중요 한 크기 순서 보다는 더 많은 했다. 따라서, estrogenic 활동 더 자주 표현 하는 ERβ 효 모 (표 2)와 함께 발견 되었다. 8 Pcp ERβ estrogenic 활동을 전시 하 고 5 Pcp ERα estrogenic 활동을 전시. 헤어 크림, 선크림, 로션, 그리고 입술 크림 샘플 재단, 면도 크림, 매니큐어 했다만 시험된 농도에서 ERβ와 estrogenic 반면 estrogenic 두 수용 체와 함께 했다. 7 다른 Pcp (4 샴푸, 비누 2, 및 1 립밤) 시험된 농도에서 두 수용 체와 estrogenic 아니었다. 수용 체의 감도 차이, 뿐만 아니라 각 샘플에 대 한 EEQs 분석 결과 (표 2)에 사용 되는 색도계 기판 (ONPG 또는 CPRG)에 따라 달랐다. 하나의 샘플 제외한 모든 ONPG를 사용 하 여 결정 하는 EEQs CPRG를 사용 하 여 결정 보다 높았다. 또한, 추출 복제 사이 변이 EEQs ERβ와 CPRG 측정에 대 한 최저 고 ERα와 ONPG (표 2) EEQs에 대 한 최고 결정. 색도계 기판 비교, 이외에 현재 연구의 1 목표 보육 학부 실험실 과정의 일정와 호환 되는 기간 시간을 테스트 했다. 전형적인 예 분석 결과 17 h 외피 바로 뒤 LacZ 버퍼에 대 일 분-4 h, 보육 주간 세션 단일 제약 교육 실험실에서 구현할 수 있는 필요 합니다. 교육에서이 분석 결과의 사용을 촉진 하는 분석 결과 17 h 부 화 후 6 d 냉각 기간 (5.1.2 단계)를 도입 하 여 수정 되었습니다. 냉장 된 격판덮개에서 표준 곡선 비 냉장 접시에서 그들에 대 등 했다 (그림 2 & 3), 매개 변수 4-매개 변수 로지스틱 회귀 모델을 사용 하 여 추정의 표준 오류 모두 했다를 제외 하 고 nonrefrigerated 플레이트 (표 3)에 대 한 보다 냉장된 번호판에 대 한 작은. 따라서, 오류 감소 6 d에 대 한 번호판을 냉동 고 EEQ 예측의 정확도 향상 시킵니다. 그림 1입니다. Microwell 플레이트 레이아웃과 표준 희석 곡선 예 분석 결과 대 한 준비. E2 표준 (밝은 회색 웰 스), 샘플 및 네거티브 추출 컨트롤 (화이트 웰 스), 그리고 차량 (h 1-3) 및 갈 락 토스 미디어 (h 10-12) 컨트롤 (어두운 회색 웰 스) 모두 3 중에서 테스트 되었습니다. E2 표준 곡선 (밝은 회색 우물) 우물 A1 a 3와 G3 통해 웰 스 B1에 효 120 µ L를 통해에 효 320 µ L를 도금 하 여 건설 되었다. E 2의 다음, 5 µ L (227.5 ERα을 표현 하는 효 모에 대 한 nM; 9.75 ERβ을 표현 하는 효 모에 대 한 nM) 우물 A1 a 3 통해 효 모에 추가 되었습니다. 효 모 + E2 정지 205 µ L를 각 우물에서 표 1에 나열 된 마지막 E2 농도 저조한 아래, 잘 옮겨서 순차적으로 희석 되었다. 참고는, 연속적인 희석 과정의 끝에, 205 µ L 폐기 해야 각 우물에서 120 µ L의 최종 볼륨을 달성 하기 위해 G3 통해 g 1은 우물에서. 샘플 및 부정적인 추출 제어 웰 스는 누 룩의 320 µ L를 각 추출 물 (50% 에탄올에 용 해)의 5 µ L을 추가 하 여 준비 되었다. 차량 제어 웰 스 (h 1-3) 효 320 µ L를 50% 에탄올의 5 µ L을 추가 하 여 준비 했다. 모든 샘플 및 제어 우물 pipetting, 혼합 했다 그리고 205 µ L을 제거 하 고 120 µ L 잘 볼륨을 조정 하려면 삭제 했다. 마지막으로, 미디어 컨트롤 우물 H10-12로 갈 락 토스 미디어의 120 µ L를 도금 하 여 준비 되었다.  부록 1 , 부록 2, e 2는 R-기반 응용 프로그램에서 LacZ 계산기를 사용 하 여 표준 곡선과 차량 및 갈 락 토스 미디어 컨트롤 해야 될 도금 같이.  샘플 및 부정적인 추출 컨트롤 도금의 순서 언급으로 화이트 웰 스에 도금 될 수 있다.  이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 2입니다. 4-매개 변수 로지스틱 회귀를 통해 생성 된 예 판에 대 한 표준 곡선. 두 기판 (ONPG & CPRG) 두 인간 에스트로겐 수용 체 (ERα 또는 ERβ) 모두 (A) 없이 중 하나를 표현 하는 누 룩을 사용 하 여 테스트 및 17β-estradiol 및 샘플 17 h 부 화 후 (B) 6 d 냉각 기간을 추출. 모든 E2 표준 및 미디어와 차량 제어 3 중에서 테스트 되었습니다. 포인트는 LacZ 값 β-galactosidase에 의해 유도 된 색상 변경의 정도 반영 하는 어디 triplicate LacZ 값의 의미를 나타냅니다. 로지스틱 회귀 모델 매개 변수는 표 3에 나와 있습니다. ONPG = 직교-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside; CPRG = chlorophenol 레드-β-D-galactopyranoside. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 3입니다. 개발된 예 판 예. 두 기판 (ONPG & CPRG) 표현 하는 인간 에스트로겐 수용 체 (ERα 또는 ERβ), 누 룩을 사용 하 여 테스트 (왼쪽) 없이 또는 17β-estradiol 또는 샘플 17 h 부 화 후 (오른쪽)는 6 일 냉동 기간으로 추출. 모든 E2 표준, 미디어 및 차량 컨트롤 triplicates에서 테스트 되었습니다. 플레이트 각 플레이트 및 컨트롤 (50% 에탄올 + 오른쪽에 왼쪽 및 갈 락 토스 미디어에 효 모) 그림 1에 따라 각 격판덮개의 맨 아래 행의 맨 위 행에서 가장 높은 E2 농도와 배열 되었다. ONPG = 직교-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside; CPRG = chlorophenol 레드-β-D-galactopyranoside.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 표준 번호 [E2] ERα 효 모 (오후)에 대 한 [E2] ERβ 효 모 (오후)에 대 한 1 3500 150 2 2208 94.6 3 1393 59.7 4 878 37.6 5 554 23.7 6 349 15 7 220 9.45 표 1입니다. 최종 농도의 E2 표준 예에 사용 합니다.가루 E2 무수 에탄올에 용 해 되었고 다음 작업 227.5의 재고 농도 희석 (ERα을 표현 하는 효 모)에 대 한 및 9.75 nM (ERβ을 표현 하는 효 모)에 대 한 50% 에탄올에.작업 주식 갈 락 토스 미디어에 효 모를 포함 하는 미 판 우물에 추가 되었고 순차적으로 테이블에 표시 된 농도에 희석. 테스트 샘플 시험 조건 Pcp의 estrogenic 등가물 (EEQs) PCP # 샘플 유형 수용 체 기판 EEQ 1 (ng/g) EEQ 2 (ng/g) EEQ 3 (ng/g) 의미 하는 EEQ (ng/g) 1 헤어 크림 ERΑ ONPG ND 0.379 ND < 0.379 1 헤어 크림 ERΑ CPRG ND ND ND ND 1 헤어 크림 ERΒ ONPG 0.528 0.338 0.363 0.410 1 헤어 크림 ERΒ CPRG ND 0.215 ND < 0.215 4 썬 스크린 ERΑ ONPG 6.803 1.390 ND < 4.097 4 썬 스크린 ERΑ CPRG ND ND ND ND 4 썬 스크린 ERΒ ONPG 1.321 0.838 0.818 0.992 4 썬 스크린 ERΒ CPRG 0.651 0.591 0.725 0.656 7 재단 ERΑ ONPG ND ND ND ND 7 재단 ERΑ CPRG ND ND ND ND 7 재단 ERΒ ONPG ND 0.158 ND < 0.158 7 재단 ERΒ CPRG ND ND ND ND 9 면도 크림 ERΑ ONPG ND ND ND ND 9 면도 크림 ERΑ CPRG ND ND ND ND 9 면도 크림 ERΒ ONPG ND 0.256 0.295 < 0.276 9 면도 크림 ERΒ CPRG 0.507 0.392 0.560 0.486 10 매니큐어 ERΑ ONPG ND ND ND ND 10 매니큐어 ERΑ CPRG ND ND ND ND 10 매니큐어 ERΒ ONPG 0.916 0.503 0.554 0.658 10 매니큐어 ERΒ CPRG 0.532 0.628 0.594 0.585 11 로션 ERΑ ONPG ND ND 2.327 < 2.327 11 로션 ERΑ CPRG ND ND ND ND 11 로션 ERΒ ONPG 범위를 초과 2.599 1.845 > 2.222 11 로션 ERΒ CPRG — 1.986 1.236 1.611 13 썬 스크린 ERΑ ONPG 14.069 11.494 10.189 11.917 13 썬 스크린 ERΑ CPRG 4.773 5.790 5.850 5.471 13 썬 스크린 ERΒ ONPG 범위를 초과 2.580 범위를 초과 > 2.580 13 썬 스크린 ERΒ CPRG 0.292 0.240 ND < 0.266 15 립밤 ERΑ ONPG ND ND 0.431 < 0.431 15 립밤 ERΑ CPRG ND ND ND ND 15 립밤 ERΒ ONPG 1.202 1.060 0.887 1.050 15 립밤 ERΒ CPRG 0.820 0.871 0.851 0.847 표 2입니다. 0이 아닌 EEQs와 Pcp의 EEQs입니다. 3 aliquots 15 Pcp 및 세 개의 추출 컨트롤의 무수 에탄올에 무 균, 증발 되었고 각각의 예 분석 결과 사용 하 여 3 중에 분석 48 샘플의 총 50% 에탄올에서 재구성. 8 Pcp 했다 1 0이 아닌 EEQ 7 Pcp 했다 시험된 농도에서 estrogenic 수 찾을 수 없습니다. 각각 별도 접시에 3 중에서 테스트, EEQ 1, EEQ 2와 EEQ 3 각 주치의의 3 aliquots를 참조 하십시오. EEQ 1, EEQ 2와 EEQ 3 값은 각 약 수에 대 한 triplicates의 수단입니다. 분석 결과에서 사용 하는 효 모 1/2 isoforms 인간 에스트로겐 수용 체 (ERα 또는 ERβ)의 표현. 두 색도계 기판, ONPG 및 CPRG, 냉장 되지 않은 프로토콜을 사용 하 여 테스트 되었습니다. EEQs e 2의 7 농도의 각각에서 LacZ 값 (R2 값 ≥ 0.98)와 4-매개 변수 로지스틱 회귀를 사용 하 여 결정 했다. ND = 분석 결과의 검출 한계 아래.-= 손실된 복제. 시험 조건 모델 매개 변수 수용 체 기판 6 d 4 ° C에서 체포 모델 R2 성장 율 (LacZ 단위/ng/ml) 굴절 지점 (ng/mL) 낮은 우리 (LacZ 단위) 위 점근 (LacZ 단위) ERΑ ONPG 아니요 > 0.99 8.548 ±1.633 -0.512 ±0.025 -1.623 ±4.408 128.11 ±6.31 ERΑ ONPG 예 > 0.99 7.618 ±0.758 -0.587 ±0.014 -8.378 ±2.223 99.53 ±2.528 ERΑ CPRG 아니요 > 0.99 8.256 ±2.182 -0.610 ±0.033 0.853 ±3.333 62.52 ±3.473 ERΑ CPRG 예 > 0.99 5.068 ±0.616 -0.523 ±0.022 -3.147 ±1.946 68.06 ±3.069 ERΒ ONPG 아니요 > 0.99 1.041 ±2.004 -0.898 ±4.410 -32.98 ±86.62 248.6 ±778.9 ERΒ ONPG 예 > 0.99 4.327 ±1.289 -1.736 ±0.087 4.654 ±3.087 66.37 ±10.75 ERΒ CPRG 아니요 0.99 = 5.673 ±1.764 -1.914 ±0.052 3.925 ±1.679 28.05 ±2.334 ERΒ CPRG 예 > 0.99 4.412 ±1.142 -1.894 ±0.051 2.052 ±1.303 22.64 ±2.047 테이블 3입니다. 매개 변수 4-매개 변수에 표준 곡선에 대 한 로지스틱 회귀 모델 그림 2. 두 기판, ONPG 및 CPRG, 누 룩 없이 고 17 h 부 화 후 6 일간 냉장 기간 1 2 인간 에스트로겐 수용 체 (ERα 또는 ERβ)의 표현을 사용 하 여 테스트 되었습니다. 매개 변수는 ±standard 오류 추정으로 보고 됩니다. 부록 1 LacZ 값 계산에 대 한 응용 프로그램.  응용 프로그램을 사용 하려면 먼저 다운로드 무료 자바 소프트웨어 ( 테이블의 자료에서 언급된). 다음 LacZ 응용 프로그램을 엽니다. 접시 레이아웃 응용 프로그램과 함께 사용 동일 접시 레이아웃 그림 1에 제시 해야 합니다. 일부 샘플 우물 사용 되지 않은 경우 빈 우물에서 흡 광도 신호는 LacZ 응용 프로그램에 붙여넣을 흡 광도 데이터 집합에서 자리 표시자로 유지 됩니다.  이 응용 프로그램에서 접시의 공간 레이아웃을 유지 하 고 그들의 원하는 위치에 미디어 컨트롤 웰 스는 되도록 합니다.  또한, 빈 셀이 응용 프로그램이 실행 되지 않습니다. (ONPG)에 대 한 OD405 읽기 또는 OD574 읽기 (CPRG)에 대 한 “컨트롤 (ctrl) + v” 키보드 명령을 사용 하 여 모든 우물의 붙여넣기 또는 “command + v를” 사용 하는 컴퓨터 플랫폼에 따라. 색상을 생산 하는 분석 결과 대 한 시간 에 부 화 시간을 입력 (단계 5.4;에서 40 분 예를 들어 0.66667 h). 다음을 클릭 합니다. 단계 5.3에서에서 OD610 독서에 붙여 넣으십시오. 전송을 클릭 합니다. LacZ 결과 표시 될 것 이다 그리고 “컨트롤 (ctrl) + c”를 누르거나 “명령 + c”는 사용 중인 컴퓨터 플랫폼에 따라 복사할 수 있습니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오. 부록 2 EEQs 계산 통계 소프트웨어 옵션. EEQs 세 가지 표시 옵션 중 하나를 사용 하 여 계산할 수 있습니다.  1을 사용 하 여에 대 한 방향입니다. JMP 소프트웨어 또는 2입니다. R 코드는 부록 2에 제공 됩니다.  R 코드 또한 3으로 변환 되었습니다. https://furmanbiology.shinyapps.io/YESapp/에서 사용할 수 있는 응용 프로그램 형식입니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오. 부록 3 데이터 수집 기질으로 효 모 그 표현 ERα와 CPRG를 사용 하 여 샘플. 측정610 명이 각각 7 E2 표준, 차량 및 미디어 컨트롤,574 명이 하 고 단일 대표 주치의 샘플 계산된 LacZ 값과 함께 포함 되어 있습니다. 표준의 LacZ 값 단계 7A에 설명 된 대로 표준 곡선의 4-매개 변수 로지스틱 회귀 모델을 만드는 데 사용 되었다 & 위 B. 모델 미 판 우물에서 ng/mL에서 대표 하는 샘플의 EEQs의 triplicate 견적 보간에 사용 되었다. 이러한 값 다음 EEQs 샘플 (단계 8.1)의 ng/g로 변환 했다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

예 물, 음식, 식물 조직, 개인 케어 제품 등 환경 샘플에서 estrogenic ligands를 검출 하는 데 사용 하는 저렴 한 비용 방법입니다. 데이터 되 게 여기 비교 2 에스트로겐 수용 체 (ERα 및 ERβ), 2 기질 (ONPG 및 CPRG), 그리고 2 타임 라인 (냉장 없이 2 d 프로토콜)과 7 일 프로토콜 냉장 예 분석 결과 통해 퍼스널 케어 제품에 estrogenicity를 측정. 한 번만 만족 하는 학부 실험실 과정에 의해 부과 된 또한 시간 제약와 호환 되는 동안 7 d 냉장된 프로토콜 사용 하 여 CPRG 및 ERα 및 ERβ를 가장 잘 표현 하는 효 모 EEQs 단정 / 여러 h 주. 사실, 냉장 없이 2 d 분석 결과에 비해, 7 일간 냉장된 분석 결과와 연관 되었다 감소 분산 판 복제에 걸쳐. 또한, 표준 곡선의 선형 부분 약간 냉장된 분석 결과 사용 하 여 수집 된 데이터에 대 한 확장 되었다. 표준 곡선의 선형 부분 분석 결과 검색 범위를 정의 하 고 샘플 EEQs 보간 하는 데 사용할 수 있는 표준 곡선의 유일한 부분입니다.

테스트 샘플 중 하나를 제외한 모든, CPRG를 사용 하 여 측정 하는 EEQs ONPG와 정량 보다 낮은 했다. 와 높은 멸종 계수 및 낮은 Km V최대, CPRG ONPG17보다 10 배 더 과민 하다. 따라서, CPRG 더 낮은 농도에서 사용할 수 있습니다 그리고 β-galactosidase의 낮은 금액을 감지 하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 이유로 CPRG ONPG,1819통해 일반적으로 기본 설정입니다. 그러나, 큰 기판 감도 낮은 EEQ 값 CPRG을 검색 설명 하지 않는다. 다른 저자2,18에 의해 설명 했 듯이 ONPG 발견 높은 EEQ 값 분석 결과, 매트릭스 방해가 때문일 수 있었다. 퍼스널 케어 제품 추출 물에서 노란 안료 ONPG 감지 하는 EEQ 값을 부 풀 려 수 있습니다. 다른 그들의 실험 디자인2, 실험에 있는 격판덮개의 수를 두 배로 하는 방법에에서 안료 컨트롤을 포함 하 여이 문제를 피할 수 있다. 매트릭스 간섭 문제가 있을 수 있습니다, 비록 더 비싼 ONPG 보다 긴 부 화 시간을 요구 한다 CPRG 예 분석 결과 대 한 바람직 기판 될 수 있습니다. 또한, β-galactosidase에 의해 기판의 분열에 의해 유도 된 색상 변경 쉽게 결과 시각화 하기 위해 학생 들을 위한 CPRG와 함께 더 극적 이다.

밀러 외. (2010), 누가이 프로토콜에 사용 되는 누 룩을 설계, 표현 ERβ 30 x 17β estradiol ERα, 우리의 데이터14에 의해 입증 발견을 표현 하는 효 모 보다 더 민감한 했다 그 누 룩을 지적 했다. 플라스 미드 건설, 밀러 그 외 여러분 에서 잠재적인 뉘앙스를 제외 하 고 (2010 년) 감도14에이 차이 설명할 수. 한 차이 두 플라스 미드 구조 ERβ 식 포도 당 또는 갈 락 토스에 의해 규제 됩니다 반면 ERα 식 갈 락 토스에 의해 통제 된다 이다. 예 시험에 사용 된 효 모 포도 당 미디어에서 교양 있으며 그들이 분석 결과의 시작에서 희석 하 때만 갈 락 토스를 주어진. 따라서, ERβ을 표현 하는 효 모 복사본 수가 수용 체 단백질 estrogenic ligands에 높은 감도 부여 함으로써 분석 결과의 시작 이전에 축적 수 있습니다.

ERα 표현 효 낮은 감도 감지 ERα ERβ와 비교 측정 샘플에서 estrogenicity의 더 높은 속도 설명할 수 있다. 가능성을 증가 하는 샘플 EEQs 검색 됩니다, 사용자 수 다른 추출 용 매 및 방법 또는 높은 볼륨 샘플의 누 룩을 추가. 높은 샘플 볼륨을 사용 하는 경우는 같은 양의 표준 및 샘플 분석 결과에 사용할 수 있습니다 표준 E2의 농도 조정 되어야 한다. 더 많은 샘플을 추가 한 한계 효 모 30 대 35 ° C20의 외피 온도에 더 나은 공차와만 6-10%의 에탄올을 참을 수입니다. 효 모에 에타 놀의 효과 제어 하려면 조사 triplicate “효 모 만” 웰 스 플레이트 레이아웃을 고이 “효 모 만” 웰 스의 OD610 즉시 비교 차량 제어 우물의 OD610 은 확인 후에 LacZ 버퍼의 추가. 또는, 에탄올에 용 해 하는 샘플 건조 microwell 접시와 효 모 추가 되기 전에 떨어져 증발 하는 에탄올에 추가할 수 있습니다. Dimethylsulfoxide (DMSO)는 또한 사용 예에 예제 용 매 분석 실험, 하지만 효 모와 DMSO의 최종 작업 농도 112에 국한 되어야 합니다.

예 시험 환경 샘플에서 estrogenicity을 탐지 하기 위한 강력한 검사 도구입니다. 특히, 예 진 식14를 에스트로겐 응답 요소와 상호 작용 하는 핵 스 트로 겐 수용 체를 바인딩하는 ligands를 감지 합니다. 그러나, 예는 또한 중요 한 제한이 있습니다. 예에 스 막 에스트로겐 수용 체 등 비 핵 메커니즘 또는 활성 제 단백질 1 (AP-1) 녹음 방송 요인에와 같은 추가 요소를 포함 하는 메커니즘을 통해 작동 하는 검색 하지 않습니다. 또한, 효 모 하지 않아도 동일한 대사 용량 포유류 세포로, 때문에 예 estrogenic 되도록 신진 대사 활성화를 필요로 하는 ligands를 검색할 수 없습니다.

또한, 예 분석 결과 구별할 수 없습니다 쉽게 복잡 한 샘플에서 estrogenic 및 안티 estrogenic ligands. 대신, net estrogenicity estrogenic 안티 estrogenic ligands의 합계 효과 측정 합니다. ER 길 항 근의 농도 정량 또는 혼합물의 금지 활동을 평가, 분석 결과 표준 길 항 제 (17β-estradiol)와 다양 한 테스트 샘플 농도12효 모 배양 하 여 수정할 수 있습니다. 이 프로세스 샘플에 길 항 근 주 작동 근 유도 기자 활동을 점감 할 수 있다 하는 경우를 결정 하 고 샘플에서 응급실 길 항 근의 존재를 식별 하는 데 유용한 화면을 제공 합니다.

일부 샘플 추출 및 샘플 준비 단계를 수정 해야 할 수도 있습니다 있지만 여기에 제시 된 프로토콜 샘플 형식의 다양 한을 수용할 수 있습니다. 예를 들어 EEQs 중 널리 다양 한 몇 가지 개인 케어 제품의 복제. 더 가변 샘플 기름 작은 물방울을 포함 하는 경향이 나 그렇지 않으면 하지 완전히 균질, 나타내는 diethyl 에테르 같은 더 질 성 용 매 도움이 될 것 이다. 또는 오일과 왁 스 퍼스널 케어 제품에 샘플 100% 에탄올 대신 50% 에탄올으로 추출 하 여 제외 될 수 있습니다.50% 에탄올 추출 더 많은 수용 estrogenic ligands (예를 들어, 일부 안료) 캡처할 것입니다. 그러나, 50% 에탄올 100% 에탄올 보다 더 느리게 증발 하 고 따라서 추출 시간을 확장할 수 있습니다. 또한, (비누) 등 일부 샘플 했다 감소 셀 밀도 측정 (OD610)에서 발생 하는 효 모 세포 독성. 여우 외. (2008) 같은 샘플 희석 하 고 셀 밀도 차이 차량 제어 웰 스12에 비해 30%를 초과 하는 경우 다시 테스트 해야 좋습니다.

예 시험 분석 연구 목적으로 사용 하는 경우 샘플 풀의 희석 곡선 선제 추출 단계 4.5에서에서 누 룩을 추가할 수의 적절 한 볼륨을 결정 하기 위해 테스트할 수 있습니다. 또는, 추출 물 시험 될 수 있다 동시에 여러 볼륨 (예:5 µ L, 20 µ L 추출 단계 4.5에서에서 효 모에 추가) 또는 주문 크기 (예를 들어, 0.2 µ L, 2 µ L, 및 20 µ L)에 걸쳐 있는 희석. “적절 한” 볼륨 추출의 표준 곡선의 선형 부분을 따라 LacZ 값을 일치 하 여 estrogenicity를 식별 하는 있습니다. 최적화는 효 모 세포 독성, false 네거티브, 또는 표준 곡선을 초과 하는 estrogenicity 등을 너무 많이 또는 너무 작은 샘플을 추가 하 여 발생 하는 문제를 방지할 수 있습니다. 위에서 설명 했 듯이, ligand의 다른 양의 효 모는 접시에 걸쳐 일관 된 볼륨 및 농도의 에탄올 또는 다른 차량에 노출 되도록 사용 하는 경우 샘플 및 E2 표준의 볼륨을 조정 합니다.

False 네거티브를 위한 잠재력에도 불구 하 고 예 분석 결과 확인 되었습니다 계층 3 테스트 도구로 내 분 비 분리기에 대 한 Schug 그 외 여러분 에 의해 (2013), 누가 내 분 비 장애 (TiPED)21에 대 한 포괄적인 계층 프로토콜을 개발. 학부 교육에 대 한 분석 결과 내 분 비 장애, 세포 배양, 수용 체 바인딩, 효소 활동, 유전 공학, 통계, 그리고 실험 설계에 관련 된 개념을 교육에 대 한 유용 합니다. 분석 결과 사용 하 여 학생 또한 직렬 표준; diluting 등 근본적이 고 광범위 하 게 적용 가능한 실험실 연습 추출 샘플; 만드는 솔루션; 구성 하 고 표준 곡선; 보간 계산 농도; 만드는 솔루션; 시연 메 마른 기술; 배양 세포; 식별 하는 변수 및 컨트롤; 수집, 조직, 및 데이터 분석 구성 하 고 해석 그래프; 그리고 micropipettors, 광 등 일반적인 실험실 장비를 사용 하 여.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 프로젝트는 시작 자금 TME 및 AMR 루이지애나 기술 대학, Furman 대학에서 각각에 의해 투자 되었다. AMR 및 국립 과학 재단 그리고 루이지애나 Regents 보드에서 TME 여행 수상에서 TME 루이지애나 EPSCoR Pfund 그랜트, 남쪽의에 관련 된 대학에서 TME 2015 교수 발전 보조금에 의해 제공 된 추가적인 자금에 남쪽의 대학입니다. 우리 감사 박사 데이비드 Eubanks (Furman) 통계 분석 및 씨 크리스토퍼 무어에 대 한 “우리에 게 주는 손을” 촬영 하는 동안.

Materials

Equipment
Vortex Mixer (for single or multiple tubes) Fisher Scientific (www.fishersci.com) 02-215-365 Any mixer will suffice.
Bucket centrifuge Fisher Scientific (www.fishersci.com) 75-063-839 Any bucket centrifuge will suffice if it is capable of centrifuging conical tubes at 4000 rpm.
Bunsen burner Fisher Scientific (www.fishersci.com) 17-012-823 Any Bunsen burner will suffice, or an alcohol burner (Fisher Scientific 04-245-1) can be used instead.
Incubator Fisher Scientific (www.fishersci.com) 50125590H Any incubator will suffice if it is capable of maintaining 30 °C.
Microplate reader BioTek (www.biotek.com) EPOCH2 A different brand of plate reader will suffice if it can measure absorbance at wavelengths of 405, 574, and 610 nm.
Gen5 microplate reader and imager software BioTek (www.biotek.com) GEN5 Software required depends on make and model of plate reader; GEN5 software is intended for use with BioTek plate reader.
Refrigerator Fisher Scientific (www.fishersci.com) 05LREEFSA Any refrigerator will suffice if it is capable of maintaining 4 °C.
Pipettor or PipetAid compatible with 1-10 ml serological pipets Fisher Scientific (www.fishersci.com) 13-681-15E Any pipettors will suffice if they are compatible with 1- and 10-ml serological pipets.
P10 micropipettor Fisher Scientific (www.fishersci.com) F144562G Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing 5 µl.
P200 micropipettor Fisher Scientific (www.fishersci.com) F144565G Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing up to 200 µl.
P300 multichannel pipettor Fisher Scientific (www.fishersci.com) FBE1200300 Any multichannel pipettor will suffice if it is capable of dispensing 50 to 205 µl.
Repeating pipettor Fisher Scientific (www.fishersci.com) F164001G Must be able to deliver 100-320 µl; this pipettor is optional because a multichannel pipettor can be used instead.
Name Company Catalog Number Comments
Supplies
Sterile 15-ml conical tubes with caps Fisher Scientific (www.fishersci.com) 05-539-801
Glass scintillation vials Fisher Scientific (www.fishersci.com) 03-337-4
Polystyrene 96-well, flat-bottom microplates with lid (non-sterile) Fisher Scientific (www.fishersci.com) 12565501
Polypropylene 96-well, flat-bottom microplates without lid  Cole-Parmer (www.coleparmer.com) EW-01728-81
100 ml glass beakers Fisher Scientific (www.fishersci.com) 02-539H Any glass beakers will suffice if they are autoclavable.
250 ml glass Erlenmeyer flasks Fisher Scientific (www.fishersci.com) FB500250 Any glass Erlenmeyer flasks will suffice if they are autoclavable.
Sterile, adhesive, porous film  VWR (www.vwr.com) 60941-086
Metal forceps Fisher Scientific (www.fishersci.com) 12-000-157 Any metal forceps will suffice.
Reagent reservoir Fisher Scientific (www.fishersci.com) 07-200-127
Filtration units (0.2 µm) Fisher Scientific (www.fishersci.com) 09-761-52
Squirt bottle (for ethanol) Fisher Scientific (www.fishersci.com) 02-897-10 Any laboratory squirt bottles will suffice.
Autoclavable storage bottles Fisher Scientific (www.fishersci.com) 06-414-1D Any autoclavable glass storage bottles will suffice.
10 ml glass serological pipets (sterile) Fisher Scientific (www.fishersci.com) 13-678-27F Any glass serological pipets will suffice.
1 ml glass serological pipets (sterile) Fisher Scientific (www.fishersci.com) 13-678-27C Any glass serological pipets will suffice.
P10 micropipettor tips USA Scientific (www.usascientific.com) 1120-3810 Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.
P200 micropipettor tips USA Scientific (www.usascientific.com) 1120-8810 Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.
P300 micropipettor tips USA Scientific (www.usascientific.com) 1120-9810 Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.
Syringe tips for repeating pipettor Fisher Scientific (www.fishersci.com) F164150G Only required if a repeating pipettor is used.
Sterile petri dishes Fisher Scientific (www.fishersci.com) FB0875712 Any sterile petri dishes will suffice.
Parafilm Fisher Scientific (www.fishersci.com) S37440
Name Company Catalog Number Comments
Yeast 
Saccharomyces cerevisiae strains that lack the TRP1 gene product (e.g. W303a) American Type Culture Company (ATCC) (www.ATCC.org) MYA-151 Recombinant yeast are also available upon request from the authors.
Receptor/reporter plasmid for ERα Addgene (www.addgene.org) pRR-ERalpha-5Z (Plasmid #23061) 
Receptor/reporter plasmid for ERβ Addgene (www.addgene.org) pRR-ERbeta-5Z (Plasmid #23062) 
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Difco agar BD (www.bd.com) 214530
Dithiothreitol Sigma (www.sigmaaldrich.com) D0632 CAUTION:  Dithiothreitol is an acute skin and eye irritant.  Use appropriate personal protection equipment (gloves, fume hood, dust mask) to avoid skin and eye contact, inhalation and ingestion.
Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside Sigma (www.sigmaaldrich.com) N1127
Chlorophenol red-β-D-galactopyranoside Sigma (www.sigmaaldrich.com) 10884308001
Yeast nitrogen base Sigma (www.sigmaaldrich.com) Y0626
Glucose Sigma (www.sigmaaldrich.com) G8270
Galactose Sigma (www.sigmaaldrich.com) G5388
Adenine sulfate Sigma (www.sigmaaldrich.com) A9126
Uracil Sigma (www.sigmaaldrich.com) U0750
Leucine Sigma (www.sigmaaldrich.com) L8000
Histidine Sigma (www.sigmaaldrich.com) H8000
17 β-Estradiol  Sigma (www.sigmaaldrich.com)                     MP Biomedicals  E8875-250 mg     0219456401 – 1 mg CAUTION:  Estradiol is a suspected carcinogen and reproductive toxicant.  It is harmful if inhaled, swallowed, or absorbed through skin.  Estradiol may cause harm to breast-fed children and fetuses.  Estradiol is very toxic to aquatic life.  Use appropriate personal protection (gloves, fume hood, dust mask) and avoid exposure during pregnancy and lactation.  Estradiol should be disposed of as hazardous waste and not released to the environment.
100% ethanol Pharmco-Aaper (www.pharmcoaaper.com) 111000200
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma (www.sigmaaldrich.com) S9638
Sodium phosphate dibasic (anhydrous) Sigma (www.sigmaaldrich.com) S0876
Magnesium chloride Sigma (www.sigmaaldrich.com) M8266
Potassium chloride Sigma (www.sigmaaldrich.com) P9333
Sarkosyl (N-lauroylsarcosine sodium salt) Sigma (www.sigmaaldrich.com) L5125
Sodium carbonate Sigma (www.sigmaaldrich.com) S7795
Name Company Catalog Number Comments
Software
Excel spreadsheet software Microsoft  Excel is convenient spreadsheet software for managing data outputs and generating .csv files for R analysis.
Java software (required for Appendix 1 application)  Oracle Corporation To calculate LacZ values using the application in Appendix 1, first download free Java software (https://www.java.com/en/download/), then open the LacZ application in Appendix 1.  LacZ results created by the application can be copied by pressing "control (ctrl) + c" on PC keyboards, or "command + c" on Mac keyboards.
JMP statistical software version 13.0.0 SAS Institute Appendix 2 includes directions on using JMP to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve.  The curve is used to interpolate test sample estradiol equivalents (EEQs), relative to the estradiol standard curve.
R statistical computing and graphics software R Foundation Free R software can be downloaded from https://www.r-project.org/.  Directions and code for using R to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve are given in Appendix 2.
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References

  1. Agradi, E., Vegeto, E., Sozzi, A., Fico, G., Regondi, S., Tome, F. Traditional healthy Mediterranean diet: estrogenic activity of plants used as food and flavoring agents. Phytother Res. 20 (8), 670-675 (2006).
  2. Morgan, H. E., Dillaway, D., Edwards, T. M. Estrogenicity of soybeans (Glycine max) varies by plant organ and developmental stage. Endocr Disruptors. 2 (1), (2014).
  3. Myers, S. L., Yang, C. Z., Bittner, G. D., Witt, K. L., Tice, R. R., Baird, D. D. Estrogenic and anti-estrogenic activity of off-the-shelf hair and skin care products. J Exp. Sci Environ Epidemiol. 25 (3), 271-277 (2015).
  4. Wagner, M., Oehlmann, J. Endocrine disruptors in bottled mineral water: estrogenic activity in the E-Screen. J Steroid Biochem Mol Biol. 127 (1-2), 128-135 (2011).
  5. Arnold, S. F., Robinson, M. K., Notides, A. C., Guillette, L. J., McLachlan, J. A. A yeast estrogen screen for examining the relative exposure of cells to natural and xenoestrogens. Environ Health Perspect. 104 (5), 544-548 (1996).
  6. Odum, J., et al. The rodent uterotrophic assay: critical protocol features, studies with nonyl phenols, and comparison with a yeast estrogenicity assay. Regul Toxicol Pharmacol. 25 (2), 176-188 (1997).
  7. Mellanen, P., et al. Wood-derived estrogens: studies in vitro with breast cancer cell lines and in vivo in trout. Toxicol Appl Pharmacol. 136 (2), 381-388 (1996).
  8. Balsiger, H. A., de la Torre, R., Lee, W. Y., Cox, M. B. A four-hour yeast bioassay for the direct measure of estrogenic activity in wastewater without sample extraction, concentration, or sterilization. Sci Total Environ. 408 (6), 1422-1429 (2010).
  9. Coldham, N. G., Dave, M., Sivapathasundaram, S., McDonnell, D. P., Connor, C., Sauer, M. J. Evaluation of a recombinant yeast cell estrogen screening assay. Environ Health Perspect. 105 (7), 734-742 (1997).
  10. De Boever, P., Demaré, W., Vanderperren, E., Cooreman, K., Bossier, P., Verstraete, W. Optimization of a yeast estrogen screen and its applicability to study the release of estrogenic isoflavones from a soygerm powder. Environ Health Perspect. 109 (7), 691-697 (2001).
  11. Fox, J. E., Burow, M. E., McLachlan, J. A., Miller, C. A. Detecting ligands and dissecting nuclear receptor-signaling pathways using recombinant strains of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nat Protoc. 3 (3), 637-645 (2008).
  12. Routledge, E. J., Sumpter, J. P. Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen. Environ Toxicol Chem. 15 (3), 241-248 (1996).
  13. Miller, C. A., Tan, X., Wilson, M., Bhattacharyya, S., Ludwig, S. Single plasmids expressing human steroid hormone receptors and a reporter gene for use in yeast signaling assays. Plasmid. 63 (2), 73-78 (2010).
  14. Delfosse, V., Grimaldi, M., Cavaillès, V., Balaguer, P., Bourguet, W. Structural and functional profiling of environmental ligands for estrogen receptors. Environ Health Perspect. 122 (12), 1306-1313 (2014).
  15. Eustice, D. C., Feldman, P. A., Colberg-Poley, A. M., Buckery, R. M., Neubauer, R. H. A sensitive method for the detection of beta-galactosidase in transfected mammalian cells. Biotechniques. 11 (6), (1991).
  16. Buller, C., Zang, X. P., Howard, E. W., Pento, J. T. Measurement of beta-galactosidase tissue levels in a tumor cell xenograft model. Methods Find Exp Clin Pharmacol. 25 (9), 713-716 (2003).
  17. Pelisek, J., Armeanu, S., Nikol, S. Evaluation of beta-galactosidase activity in tissue in the presence of blood. J Vasc Res. 37 (6), 585-593 (2000).
  18. Gray, W. D. Studies on the alcohol tolerance of yeasts. J Bacteriol. 42 (5), 561-574 (1941).
  19. Schug, T. T., et al. Designing endocrine disruption out of the next generation of chemicals. Green Chem. 15 (1), 181-198 (2013).

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Citer Cet Article
Edwards, T. M., Morgan, H. E., Balasca, C., Chalasani, N. K., Yam, L., Roark, A. M. Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory. J. Vis. Exp. (131), e55754, doi:10.3791/55754 (2018).
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