Индукция гипоксии у живых лягушек и эмбрионов рыбок данио

Исследование Hypoxia имеет множество применений. К ним относятся исследование патогенеза и разработка методов лечения заболеваний, характеризующихся гипоксией ¹ и острой больничной болезнью ² . Гипоксический стресс вызывает значительные метаболические изменения во всех организмах, нуждающихся в кислороде. Гипоксический стресс также влияет на рост и развитие плода и патогенез нескольких заболеваний человека, включая ограничение внутриутробного роста ³ . Гипоксический стресс может не только приводить к снижению веса при рождении, плода и неонатальной смертности, но также может привести к многим осложнениям во взрослой жизни, таким как сердечно-сосудистые заболевания, диабет типа 2, ожирение и гипертония ⁴ . Гипоксический стресс также часто наблюдается при развитии солидной опухоли, когда опухолевая ткань перерастает в кровь. Поэтому важно иметь возможность изучать влияние гипоксии in vivo и непосредственно во время эмбриона Йонное развитие.

Среди наиболее известных методов, используемых для изучения эффектов гипоксии во время развития, является использование хлорида кобальта в среде роста или инкубация организма в гипоксической камере. Хлорид кобальта искусственно вызывает гипоксический ответ при нормальной концентрации кислорода из-за его роли в стабилизации гипоксически-индуцируемого фактора-1 альфа (HIF-1α), предотвращая его протеосомную деградацию ^{5 , 6 , 7} . Однако, являясь удобным методом ⁸ , использование хлорида кобальта, а также других аналогичных миметиков химической гипоксии может оказывать неспецифическое вредное воздействие на клетки и ткани, например , на апоптоз ⁹ . Поэтому гипоксические камеры являются лучшим методом индукции «естественной гипоксии» в живых организмах в процессе нормального развития.

Ntent "> Мы сосредоточились на разработке системы индукции гипоксии у эмбрионов водных животных. Как лягушки, так и рыбки данио теперь стали информативными модельными организмами-позвоночных для изучения многочисленных биологических процессов, а также моделей для различных заболеваний человека. Зародыши лягушек и рыбок данио Развиваются внешне, устраняя усложнение материнской компенсации. Кроме того, быстрый курс развития позволяет манипулировать факторами окружающей среды и наблюдать фенотипические изменения в формировании органов в реальном времени. Кроме того, многие компоненты основных путей передачи сигналов в значительной степени сохраняются в Эти модельные организмы и были подробно охарактеризованы большим объемом литературы. Главное преимущество использования лягушек и эмбрионов рыбок данио для изучения влияния гипоксии на развитие позвоночных заключается в том, что все процессы можно контролировать напрямую, так как кислород быстро проникает в эмбрионы. Таким образом, у лягушек и данио, как в отличие от других модельных организмов, таких какМышиные эмбрионы, влияние удельной концентрации кислорода можно исследовать в интересующей ткани, не принимая во внимание наличие или отсутствие функциональной сосудистой сети.

Большинство коммерчески доступных установок для гипоксической инкубации имеют недостаток в том, что они сравнительно большие и имеют соответственно высокие эксплуатационные расходы. Помимо высокой начальной стоимости и потребления газа, уравновешивание и поддержание общих гипоксических камер требует поддержания постоянной гипоксической атмосферы против газового градиента, который естественным образом возникает в этих камерах из-за их более крупного размера и / или дыхания организма. Это требует использования газовых вентиляторов и системы охлаждения, что увеличивает количество дополнительного необходимого оборудования, затрудняет ловкость исследователя и в целом снижает простоту экспериментальной процедуры. Напротив, установка, представленная здесь, является сравнительно надежной, но очень рентабельной, небольшой, простой в установке и позволяет fГазового равновесия, стабильной гипоксической атмосферы и простого обмена материалами и растворами внутри камеры. Наша система может использоваться для использования с любым интересующим организмом водной модели.

Мы построили гипоксическую камеру, которая удобно мала и поэтому может быть помещена в общий лабораторный инкубатор, что легко позволяет экспериментальные процедуры при любой определенной температуре. Обеспечивая удобное управление температурой, а также концентрацию кислорода в среде, преимущество нашей системы против коммерчески доступных инкубаторов гипоксии заключается в ее небольших размерах и экономической эффективности. Таким образом, наша установка может быть установлена ​​с использованием общих лабораторных материалов, доступных для большинства исследовательских лабораторий, и не требует каких-либо дорогостоящих материалов. Кроме того, наша установка не генерирует тепло, в отличие от коммерчески доступных инкубаторов гипоксии, и позволяет использовать при температурах ниже комнатной температуры, размещенных в инкубаторе. The laSt особенно важна для работы с хладнокровными организмами, такими как лягушки и рыба, где скорости развития и метаболизма сильно зависят от температуры.

Будучи очень экономичной и легко построенной, наша камера газового инкубатора, тем не менее, очень универсальна при установлении различных гипоксических или гипероксических условий, а также позволяет быстро и легко вводить различные среды и растворы для огромного количества экспериментальных условий. Кроме того, с использованием 24-луночного планшета вместо обычно используемых блюд или лабораторных резервуаров ^{10 , 11 , 12} наша система позволяет наблюдать и экспериментально обрабатывать несколько условий мутанта сразу.

Чтобы контролировать правильную индукцию гипоксии, мы контролировали уровни белка HIF-1α путем вестерн-блот-детектирования. Кроме того, количество пролиферирующих клеток до и после инкубацииN в гипоксической камере можно использовать для определения того, была ли индуцирована гипоксия в ткани. Этот метод основан на наших ранее опубликованных результатах ¹³ , свидетельствующих о том, что при индукции гипоксии снижается пролиферация в нише стволовых клеток эмбриональной сетчатки. Таким образом, мы контролировали уровень пролиферации стволовых клеток сетчатки путем добавления 5-этинил-2'-дезоксиуридина (EdU) к среде эмбриона и измерения его включения в ДНК вновь пролиферирующих клеток.