Protein-tRNA-agarosgel-retardationsanalyser för analys av<em> N</em<sup> 6</sup> -treonylkarbamoyladenosin-TcdA-funktionen
Summary
Ett protokoll presenteras för produktion av tRNA (UUU) och analysen av tRNA (UUU) i komplex med enzymet TcdA genom agarosgel-retardationsanalyser.
Abstract
Vi demonstrerar metoder för uttryck och rening av tRNA (UUU) i Escherichia coli och analysen genom gel-retardationsanalyser av bindningen av tRNA (UUU) till TcdA, ett N6-treonylkarbamoyladenosin (t6A) dehydratas, som cykliserar treonylkarbamoylen Sidokedja fäst vid A37 i anticodonstamslingan (ASL) av tRNA till cyklisk t 6 A (ct 6 A). Transkription av den syntetiska genen som kodar för tRNA (UUU) induceras i E. coli med 1 mM isopropyl-P-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) och cellerna innehållande tRNA skördas 24 h efter induktion. RNA-fraktionen renas med användning av syrafenol-extraktionsmetoden. Ren tRNA erhålles genom en gelfiltreringskromatografi som effektivt separerar de små mängderna tRNA-molekylerna från större intakta eller fragmenterade nukleinsyror. För att analysera TcdA-bindning till tRNA (UUU) blandas TcdA med tRNA (UUU) och separeras på en naturlig agarosgel vid 4 ° C.Det fria tRNA (UUU) migrerar snabbare, medan TcdA-tRNA (UUU) -komplexen genomgår en rörelsehämmande som kan observeras vid färgning av gelén. Vi visar att TcdA är ett tRNA (UUU) bindande enzym. Denna gel-retardationsanalys kan användas för att studera TcdA-mutanter och effekterna av tillsatser och andra proteiner vid bindning.
Introduction
Gel-retardationsanalysen 1 (även känd som elektroforetisk rörlighetskifteanalys, EMSA) är en elektroforetisk metod avsedd att studera och karaktärisera protein-nukleinsyrainteraktioner. Det möjliggör analys av protein-DNA såväl som protein-RNA-interaktioner och i synnerhet interaktioner mellan tRNA och tRNA-bindande proteiner, med användning av antingen renade komponenter eller komplexa blandningar av proteiner (t ex celllysater) eller nukleinsyror (t ex tRNA pooler). Vi har tillämpat gelretardationsanalyser för studien av interaktionen mellan renat tRNA (UUU) och TcdA, ett N6-treonylkarbamoyladenosin (t6A) dehydratas, vilket cykliserar treonylkarbamoyl-sidokedjan bunden till A37 i anticodon-stamslingan (ASL) Av tRNA till cyklisk t6 (ct 6A) 2 , 3 . TcdA är också känd som CsdL 3 ,Fc> 4. TcdA / csdL- genen bildar ett kluster med csdA- och csdE- generna 5 , som kodar för cystein-desulfuraset och svavelacceptorn för cysteinsulfinas-desulfinat-systemet (CSD) och krävs för att bibehålla TcdA-funktionen in vivo 3 .
Rationalet bakom gel-retardationsanalyserna är att medan de fria nukleinsyramolekylerna snabbt flyter till framsidan av akrylamid- eller agarosgeler på grund av sin stora negativa laddning, reduceras den elektroforetiska rörligheten för proteinkomplex av samma nukleinsyror dramatiskt. Minskningen i rörlighet visualiseras som ett "skift" i nukleinsyra-proteinkomplexen, vilka löser som diskreta band. Positivt laddat och större nukleinsyra-proteinkomplex uppvisar en större förändring eller minskning av rörligheten på en gel.
Eftersom laddningseutralisering av komplexet är ett universellt fenomenFör protein-nukleinsyrakomplex kan gelretardationsanalysen appliceras på ett brett spektrum av komplex och nukleinsyratyper. Metoden är enkel, billig och kan utföras i laboratorier med minsta utrustning. Det kräver endast små mängder proteiner och tRNA. Detta är en fördel jämfört med alternativa biofysiska tekniker, som vanligtvis konsumerar större mängder prov.
Gel-retardationsanalysen har använts i stor utsträckning för studier av transkriptionsfaktorer. Analysen har använts för att analysera bindningskinetik, styrka och specificitet av transkriptionsfaktorer för många olika DNA-sekvenser. Det var verkligen på detta område att EMSA utvecklades första 6 , 7 . Gel-retardationsanalyser med RNA 8 , 9 , 10 , 11 och tRNA-molekyler har också använts i ribosomforskningOch att analysera, som vi gör här, de enzymer som modifierar tRNA-nukleosider efter transkriptionellt.
Många olika parametrar påverkar resultatet av en gel-retardationsanalys, såsom temperatur, kvalitet hos proteinet och tRNA-provet och bindningsstyrkan. Noggrann planering och genomförande av experimentet är avgörande för tolkningen av resultaten av fria nukleinsyra och proteinbundna arter. Här använde vi den syntetiska genen som kodar för tRNA (UUU) klonad i en expressionsvektor vars promotor saknar Shine-Dalgarno-ribosombindningssätet, vilket leder till syntesen av stora mängder av tRNA 2 . Detta detaljerade protokoll är avsett att ge en tydlig guide för att utföra tRNA-gelretardationsexperiment samtidigt som man undviker vanliga misstag.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protein-tRNA agaros gel-retardationsanalysen som beskrivs häri kan modifieras på ett antal sätt. För det första kan procentandelen agaros i gelén reduceras för att möjliggöra separation och visualisering av protein-tRNA-komplexa signifikant större än den som analyseras här (120 kDa). För det andra, om målproteinet är termolabilt måste extra försiktighetsåtgärder vidtas för att säkerställa att temperaturen hålls under den maximala acceptabla temperaturen genom att förflytta elektroforesapparaten t…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MCV är medlem i CIB Intramural Program "Molecular Machines for Better Life" (MACBET). Forskningen som leder till dessa resultat har fått finansiering från det spanska institutet Salud Carlos III (PI12 / 01667 till MCV), den spanska ministeriet för ekonomi och konkurrensdeltagande (CTQ2015-66206-C2-2-R och SAF2015-72961-EXP till MCV ), Regionen Madrid (S2010 / BD-2316 till MCV) och Europeiska kommissionen (ramprogram 7 (K7)) projektet ComplexINC (kontrakt nr 279039 till MCV). Fundrarna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera eller förbereda manuskriptet.
Materials
| E. coli BL21(DE3) | Novagen | 70235 | DE3 lysogen contains T7 polymerase upon IPTG induction. |
| pET23d | Novagen | 69748-3 | pET23d confers resistance to ampicillin; T7 promoter. |
| LB Broth, Low Salt (Lennox L Broth), Granulated | Melford | GL1703 | Conventional LB Broth, High Salt, can also be used. |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | 10419313 | |
| Incubator Shaker (Thermostated) | NBS | Excella E24 | Any shaker incubator with temperature control can be used. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), >=99% | Acros Organics | BP1755 | |
| Sodium acetate, anhydrous, >99% | Melford | B4017 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Disodium salt, >99% | Acros Organics | AC327205000 | Harmful if inhaled. |
| Centrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5430 | |
| Centrifuge (refrigerated) rotor | Eppendorf | 5430/5430P | |
| Centrifuge | Sorvall | RC5C | |
| Centrifuge rotor | Sorvall | SLA-3000 | |
| Phenol solution, Saturated with 0.1 M citrate buffer, pH 4.3 ± 0.2 | Sigma-Aldrich | P4682 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), corrosive |
| Ethanol absolute for analysis, 100% v/v | Merck Millipore | 100983 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate, Na2HPO4, >=99% | Sigma-Aldrich | 71643 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | Merck | 48,730,250 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 75 | GE Healthcare | 28989333 | |
| Agarose | Melford | MB1200 | |
| Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl] | Melford | T1513 | |
| Boric Acid | Melford | B0503 | |
| Microwave | Haier | HDA-2070M | |
| TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride] | Sigma-Aldrich | C4706 | Corrosive to metals and skin. |
| ATP [Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate], Grade I, >=99% | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Magnesium chloride (MgCl2), anhydrous, >=98% | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Sodium chloride (NaCl), >99% | Fisher Bioreagents | BP358 | |
| Potassium chloride (KCl), >99% | Melford | P0515 | |
| NZYDNA Ladder VI | NZYtech | MB8901 | |
| Power supply | Consort | EV261 | |
| Electrophoresis unit | Real Laboratory | RELSMINI10 | |
| Real Safe nucleic acid staining | Real Laboratory | RBMSAFE | 20,000X stock |
| UV Transilluminator (G:Box/EF) | Syngene | 2216498 | |
| Coomassie Brilliant Blue G | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Rocker (Gyro-Rocker) | Stuart | SSL3 | |
| Mixer Vortex | Fisher brand | 13214789 |
References
- Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. The gel retardation assay. Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).
- López-Estepa, M., et al. The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily. Plos One. 10 (4), e0118606 (2015).
- Miyauchi, K., Kimura, S., Suzuki, T. A cyclic form of N6-threonylcarbamoyladenosine as a widely distributed tRNA hypermodification. Nat Chem Biol. 9 (2), 105-111 (2013).
- Bolstad, H. M., Botelho, D. J., Wood, M. J. Proteomic analysis of protein-protein interactions within the Cysteine Sulfinate Desulfinase Fe-S cluster biogenesis system. J Proteome Res. 9 (10), 5358-5369 (2010).
- Loiseau, L., Ollagnier-de Choudens, S., Lascoux, D., Forest, E., Fontecave, M., Barras, F. Analysis of the heteromeric CsdA-CsdE cysteine desulfurase, assisting Fe-S cluster biogenesis in Escherichia coli. J Biol Chem. 280 (29), 26760-26769 (2005).
- Fried, M. G., Crothers, D. M. Equilibrium studies of the cyclic AMP receptor protein-DNA interaction. J Mol Biol. 172 (3), 241-262 (1984).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).
- Rio, D. C. Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (4), 435-440 (2014).
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Yakhnin, A. V., Yakhnin, H., Babitzke, P. Gel mobility shift assays to detect protein-RNA interactions. Methods Mol Biol. 905, 201-211 (2012).
- Ream, J. A., Lewis, L. K., Lewis, K. A. Rapid agarose gel electrophoretic mobility shift assay for quantitating protein: RNA interactions. Anal Biochem. 511, 36-41 (2016).
- Hagel, L. Gel-filtration chromatography. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
