Gel-retardasjonsanalysen ¹ (også kjent som elektroforetisk mobilitetsforskyvningsanalyse, EMSA) er en elektroforetisk metode designet for å studere og karakterisere protein-nukleinsyre-interaksjoner. Det muliggjør analyse av protein-DNA samt protein-RNA-interaksjoner og spesielt interaksjoner mellom tRNA og tRNA-bindende proteiner ved bruk av enten rensede komponenter eller komplekse blandinger av proteiner ( f.eks . Cellelysater) eller nukleinsyrer ( f.eks . TRNA pools). Vi har anvendt gel-retardasjonsanalyser til studien av samspillet mellom renset tRNA (UUU) og TcdA, en N6-treonylkarbamoyladenosin (t6A) dehydratase, som cykliserer treonylkarbamoyl-sidekjeden festet til A37 i anticodonstamsløyfen (ASL) Av tRNA til syklisk t6 (ct 6A) ^{2 , 3} . TcdA er også kjent som CsdL ^{3 ,}F "> 4. TcdA / csdL- genet danner en klynge med csdA- og csdE- genene ⁵ , som koder for cystein-desulfurasen og svovelacceptoren for cystein-sulfinase desulfinat-systemet (CSD) og er nødvendig for å opprettholde TcdA-funksjonen in vivo ³ .

Begrunnelsen bak gel-retardasjonsanalysene er at mens fri nukleinsyremolekyler migrerer raskt til forsiden av akrylamid- eller agarosegeler på grunn av deres store negative ladning, reduseres den elektroforetiske mobilitet av proteinkomplekser av de samme nukleinsyrer dramatisk. Reduksjonen i mobilitet visualiseres som et "skifte" i nukleinsyre-protein-kompleksene, som løses som diskrete bånd. Positivt ladet og større nukleinsyre-proteinkompleks viser større skift eller reduksjon i mobilitet på en gel.

Siden ladningsnøytralisering av komplekset er et universelt fenomenFor protein-nukleinsyrekomplekser kan gel-retardasjonsanalysen påføres et bredt spekter av komplekser og nukleinsyre-typer. Metoden er enkel, billig og kan utføres i laboratorier med minimum utstyr. Det krever bare små mengder proteiner og tRNA. Dette er en fordel i forhold til alternative biofysiske teknikker, som vanligvis forbruker større mengder prøve.

Gel-retardasjonsanalysen har blitt mye brukt til studiet av transkripsjonsfaktorer. Analysen har blitt brukt til å analysere bindende kinetikk, styrke og spesifisitet av transkripsjonsfaktorer for mange forskjellige DNA-sekvenser. Det var faktisk på dette feltet at EMSA ble først utviklet ^{6 , 7} . Gel-retardasjonsanalyser med RNA ^{8 , 9 , 10 , 11} og tRNA-molekyler har også vært anvendt i ribosomforskningOg for å analysere, som vi gjør her, enzymer som modifiserer tRNA nukleosider post-transkriptjonelt.

Mange forskjellige parametere påvirker resultatet av en gelforsinkelsesanalyse, slik som temperatur, kvalitet på proteinet og tRNA-prøven og bindingsstyrken. Forsiktig planlegging og utførelse av forsøket er avgjørende for tolkningen av resultatene av fri nukleinsyre og proteinbundne arter. Her brukte vi det syntetiske gen som koder for tRNA (UUU) klonet i en ekspresjonsvektor hvis promotor mangler Shine-Dalgarno ribosombindingsstedet, hvilket fører til syntese av store mengder av tRNA ² . Denne detaljerte protokollen er ment å gi en klar veiledning for å utføre tRNA gelretarderingsforsøk samtidig som man unngår vanlige feil.