FRET di alta precisione a singolo livello molecolare per la determinazione della struttura biomolecola

Un obiettivo fondamentale degli studi di biologia strutturale è quello di svelare il rapporto tra la struttura e la funzione delle macchine biomolecolari. La prima impressione visiva delle biomolecole ( es. Proteine ​​e acidi nucleici) si è verificata negli anni '50 attraverso la cristallografia a raggi X a sviluppo. La cristallografia a raggi X fornisce informazioni strutturali statiche ad alta risoluzione, vincolate dall'imballaggio in cristallo. Pertanto, l'immobilità intrinseca dei modelli strutturali a raggi X evita la natura dinamica delle biomolecole, un fattore che influenza la maggior parte delle funzioni biologiche ^{3 , 4 , 5} . La risonanza magnetica nucleare (NMR) ^{6 , 7 , 8 ha} fornito una soluzione alternativa al problema risolvendo i modelli strutturali in soluzioni acquose. Un grande vantaggioDi NMR è la sua capacità di recuperare la natura dinamica intrinseca delle biomolecole e degli ensemble conformazionali, che aiuta a chiarire le relazioni intrinseche tra struttura, dinamica e funzione ^{3 , 4 , 5} . Tuttavia, NMR, limitato per dimensione del campione e grandi quantità di campioni, richiede strategie complesse di etichettatura per i sistemi più grandi. Pertanto, c'è una necessità urgente di sviluppare metodi alternativi nella biologia strutturale.

Storicamente, il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) ⁹ non ha assunto un ruolo importante nella biologia strutturale a causa del malinteso che FRET fornisce misure di distanza a bassa precisione. Lo scopo di questo protocollo è quello di rivedere la capacità di FRET di determinare le distanze sulla scala nanometrica, in modo tale che queste distanze possano essere utilizzate per la costruzione di modelli strutturali di biomolecole. La prima verifica sperimentaleLa dipendenza della R ^{– 6} dall'efficienza FRET è stata fatta da Stryer nel 1967 ¹⁰ misurando poliproline di varie lunghezze come "righello spettroscopico". Un esperimento simile è stato raggiunto a livello monomolecolare nel 2005 ¹¹ . Le molecole di poliproline risultarono non ideali e quindi le molecole a DNA a doppio filamento sono state successivamente utilizzate ¹² . Questo ha aperto la finestra per la misurazione precisa delle distanze e l'idea di utilizzare FRET per identificare le proprietà strutturali delle biomolecole.

FRET è ottimale quando la distanza di interdye è da ~ 0.6-1.3 R ₀ , dove R ₀ è la distanza di Förster. Per i fluorofori tipici utilizzati nei singoli esperimenti di FRET, R ₀ è ~ 50 Å. Tipicamente, FRET offre molti vantaggi rispetto ad altri metodi nella sua capacità di risolvere e differenziare le strutture e le dinamicheI sistemi eterogenei: (i) A causa della massima sensibilità della fluorescenza, gli esperimenti FRET a singola molecola ^{13 , 14 , 15 , 16} possono risolvere complessi eterogene contando direttamente e caratterizzando simultaneamente le strutture dei singoli membri. (Ii) I percorsi complessi di reazione possono essere decifrati direttamente negli studi di FRET mono-molecolari perché non è necessaria alcuna sincronizzazione di un ensemble. (Iii) FRET può accedere a un'ampia gamma di domini temporali che durano più di 10 decenni nel tempo, coprendo un'ampia gamma di dinamica biologicamente rilevanti. Iv) Gli esperimenti FRET possono essere eseguiti in tutte le condizioni di soluzione, sia in vitro sia in vivo . La combinazione di FRET con microscopia a fluorescenza consente lo studio delle strutture molecolari e delle interazioni direttamente nelle cellule viventi ^{15 , 16 ,} </ Sup> ^{17 , 18 , 19} , anche con alta precisione ²⁰ . (V) FRET può essere applicato a sistemi di quasi tutte le dimensioni ( ad es. Oligomeri poliprolina ^{21 , 22 , 23 , 24} , Hsp90 ²⁵ , reversi transcriptasi HIV ²⁶ e ribosomi ²⁷ ). Vi) Infine, una rete di distanze che contenga tutta la dimensionalità delle biomolecole potrebbe essere utilizzata per derivare modelli strutturali di molecole statiche o dinamiche ^{18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,}Ref "> 35 ^{, 36 , 37} .

Pertanto, la spettroscopia FRET a singola molecola può essere utilizzata per ottenere distanze sufficientemente precise da utilizzare per la modellazione strutturale a distanza ²⁶ . Ciò è possibile sfruttando il rilevamento di fluorescenza multiparametri (MFD) ^{28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42} , che utilizza otto dimensioni di informazioni di fluorescenza ( es. Spettro di eccitazione, spettro di fluorescenza, anisotropia, durata della fluorescenza, Tempo macroscopico, intensità della fluorescenza e distanza tra i fluorofori) per fornire precisi e precisi ritratti di distanza. Inoltre, l'eccitazione interpolata pulsata (PIE) è combinata con MFD(PIE-MFD) ⁴² per monitorare la fluorescenza dell'accettore di eccitazione diretta e per selezionare eventi a singola molecola derivanti da campioni contenenti uno stoichiometria donatore da accettazione a 1: 1. Una tipica configurazione PIE-MFD utilizza laser a eccitazione interpolati a due pulsanti collegati ad un corpo microscopio confocale, dove il rilevamento fotonico è suddiviso in quattro canali diversi in diverse finestre spettrali e nelle caratteristiche di polarizzazione. Ulteriori dettagli possono essere trovati nella Figura 1 .

È importante notare che la FRET deve essere combinata con metodi computazionali per ottenere modelli strutturali simili a quelli atomici che sono coerenti con i risultati FRET ^{26 , 30} . Non è l'obiettivo del presente protocollo di superare la metodologia associata per costruire modelli strutturali con distanze derivate da FRET. Tuttavia, questi approcci sono stati applicati in combinazione con altre tecniche ( ad esempio, dispersione a raggi X a piccole angolazioni)O risonanza paramagnetica dell'elettrone), dando vita al campo della biologia strutturale integrativa ^{43 , 44 , 45 , 46} . L'obiettivo attuale è quello di aprire la strada a FRET come strumento quantitativo nella biologia strutturale. Ad esempio, questa metodologia è stata usata per identificare tre stati conformazionali nel dominio legante-legame (LBD) del recettore N-methyl-D-aspartato (NMDA). Il fine ultimo è quello di superare le limitazioni di cui sopra e di portare FRET tra i metodi integrativi utilizzati per la determinazione strutturale delle biomolecole fornendo distanze misurate con alta precisione.