Técnica laparoscópica para la Recolección de serie del hígado y los ganglios linfáticos mesentéricos en macacos

Los animales fueron alojados y atendidos en la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care International (AAALACi) instalaciones acreditadas, y todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo a los protocolos aprobados por el Comité Institucional Animal Cuidado y Uso (IACUC) de la Universidad de Washington y National Primate Research Center de Washington. 1. Surgical Preparación, anestesia y analgesia La sedación y la inducción Sedar al macaco con una inyección intramuscular de 10 mg / kg de ketamina y 0,015 mg / kg de dexmedetomidina (combinados en una jeringa). Asegurar la ausencia de reflejos de retirada antes de retirarlos de la jaula. Intubar al animal, y mantener al animal en un plano de anestesia general usando isoflurano (1.0 – 2,5%) y 100% de oxígeno. Ver referencias para mayor información con respecto a la intubación y anestesia general en macacos 17,ref "> 18, 19. Anestesia apoyo y seguimiento Insertar un catéter venoso periférico y proporcionar líquidos isotónicos intravenosos (tales como lactato de solución de Ringer) a una velocidad de 5 ml / kg / h a lo largo de la anestesia y la cirugía. Aplicar lubricante ocular estéril para evitar la sequedad de la córnea. Proporcionar analgesia, tal como una formulación de liberación sostenida de buprenorfina (0,2 mg / kg, por vía subcutánea). NOTA: un NSAID (tales como meloxicam o ketoprofeno) también puede estar provista durante la recuperación anestésica, siempre que el protocolo experimental permite la administración de AINE y que animal es normotensa y bien hidratado durante la anestesia. Monitor de profundidad de la anestesia (por ejemplo, tono de la mandíbula), la frecuencia cardíaca, frecuencia respiratoria, EKG, presión arterial, la oxigenación del pulso, final de la espiración CO 2, y la temperatura corporal a lo largo de la anestesia y la cirugía. NOTA: Cuando se insufla el abdomen, el animal puede hypoventilate.Proporcionar ventilación mecánica si la tasa de respiración disminuye, o el extremo de marea niveles de CO 2 está por encima de 45 mmHg. Después de la cirugía, administrar atipamezol (0,15 mg / kg, intramuscular) para la inversión de dexmedetomidina. Preparación quirúrgica Realizar múltiples enemas de agua caliente para reducir el volumen de las heces en el colon para ayudar a la visualización y manipulación intestinal durante el procedimiento 20. Use máquinas de cortar con una cuchilla número 40 para eliminar el vello del campo quirúrgico. Afeitarse desde la cresta costal hasta el pubis y desde la izquierda a flanco derecho. Asépticamente preparar el campo quirúrgico utilizando antisépticos apropiados, tales como alternando clorhexidina-alcohol o povidona-yodo-alcohol friega. Coloque el animal en la mesa de operaciones en su dorso, a una mitad de camino ángulo entre dorsal y decúbito lateral derecho. Atar los brazos y las piernas con una cuerda en una posición extendida. Proporcionar una chlorhexi definitivacenar y prep alcohol vez que el animal se mueve a la sala de operaciones y está posicionada para la cirugía. 2. Cirugía Nota: Para obtener más información de la laparoscopia en animales pequeños, véase la referencia 21. Laparoscópica Preparación Instrumento Coloque el animal con un paño fenestrado estéril. Con la ayuda de un asistente no estéril, envuelva la cámara digital con la cortina de la cámara estéril y conecte el cable a la torre. Una el endoscopio rígido a la cabeza de la cámara. Una el cable de luz estéril para el alcance rígido y conectar el cable a la fuente de luz. Balance de blancos de la cámara de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Una el tubo insuflador estéril para el insuflador. Entrada laparoscópica El uso de un bisturí # 15, hacer un ~ 5 mm incisión a través de la piel a la profundidad de la musculatura abdominal, approximately 1 – 2 cm a la izquierda del ombligo. Con la mano no dominante, levantar la pared abdominal craneal al sitio de la incisión. Con la mano dominante, coloque la punta de la aguja de Veress través de la incisión y el ángulo de la punta cranealmente. NOTA: El ángulo de penetración de la aguja de Veress variará en función de la condición corporal de los animales. Por ejemplo, en un animal de grasa, tendrá que ser insertado casi perpendicular a la pared abdominal de la aguja Veress. En un animal delgado, la aguja de Veress debe estar en ángulo cranealmente para reducir el riesgo de poner en contacto las vísceras. Sosteniendo el eje (no el cubo) de la aguja de Veress, empuje firmemente la aguja para penetrar la pared abdominal en la cavidad abdominal. Un distinto "clic" y disminución de la resistencia se sintió como la punta afilada penetra en el peritoneo y la punta roma de los resortes de aguja de Veress hacia delante en la cavidad abdominal. NOTA: Si la aguja pasa apropiadamente en ºe cavidad abdominal, habrá poca resistencia cuando es avanzada y retirada de 1 – 2 cm. Conectar el tubo insuflador CO 2 a la aguja y abrir la llave de paso. Presurizar el abdomen a no más de 10-12 mmHg para crear un neumoperitoneo. NOTA: El abdomen ha alcanzado la insuflación ideal cuando se ha expandido de forma simétrica y hay una pérdida del contorno afilado normal de los bordes costales. La presión debe proporcionar un espacio adecuado para la inserción de la cánula / trocar sin riesgo de contacto con las vísceras. La colocación de la cánula Una vez que el abdomen está totalmente insufla, hacer un ~ 5 – mm incisión 7 con una hoja de bisturí # 15 a través de la piel del abdomen craneal izquierda a la musculatura abdominal ~ de 2 – 4 cm caudal a la última costilla. Colocar un conjunto de trocar-cánula 5 mm a través de la incisión de la piel y el ángulo de TI ~ 45 – 60 grados caudomedially. Penetrar en la cavidad abdominal a una profundidad de 1-2 cm. screw la cánula roscada en el abdomen mediante la rotación de la cánula (~ 0,5 – 1 cm más) a una profundidad de 1,5 – 3 cm, y retirar el trocar. Retire el tubo insuflador de la aguja de Veress, apague la llave de paso, y retirar la aguja. Conectar el tubo insuflador a la cánula y abrir la llave de paso de mantener un neumoperitoneo a no más de 10 – 12 mmHg. Insertar el endoscopio rígido a través de la cánula y en la cavidad abdominal. Bajo visualización cámara, continuar haciendo una pequeña incisión con una hoja de bisturí # 15 a través de la musculatura abdominal y el peritoneo en la incisión de la piel anterior utilizado para la inserción de la aguja de Veress. La cámara se utiliza para visualizar el lado abdominal de la incisión para evitar los vasos y minimizar el sangrado. NOTA: Asegúrese de que la incisión a través del músculo y peritoneo es lo suficientemente grande como para facilitar la entrada de la sonda y exteriorización del mesenterio (~ 0,5 cm). Una incisión más grande puede ser requerido para exteriorizar mesentery en los animales con exceso de grasa mesentérica. Colocar el animal en posición de Trendelenburg 21 con los pies elevados en aproximadamente 15 – 30 grados por encima de la cabeza. Esto es opcional pero puede permitir un acceso más fácil a los ganglios linfáticos mesentéricos de colon, como el pequeño tracto intestinal se moverá a una posición más craneal. Mesentérica biopsia del ganglio Bajo visualización cámara, inserte una sonda sólida a través de la incisión abdominal hecha en el paso 2.3.5. Coloque la sonda entre el omento y el intestino y el uso de un movimiento de barrido para barrer suavemente el epiplón fuera del intestino para permitir la visualización del mesenterio subyacente. El uso continuado del movimiento de barrido del caudal a craneal del abdomen. El omento se puede colocar en el derecho abdomen craneal por lo que está fuera del campo operatorio. Utilice la sonda para mover el colon descendente hacia la pared abdominal izquierda o hacia la derecha. Esto permitirá una mejor visualización de tque mesenterio para ayudar en la búsqueda de los ganglios linfáticos mesentéricos. Utilice la sonda para barrer a través del mesenterio para localizar los ganglios linfáticos mesentéricos a lo largo de los vasos de colon y mesentéricos. NOTA: Los nodos del colon corren a lo largo del borde mesentérico del colon, los nodos cólicos izquierdos se puede encontrar cerca de los puntos de ramificación de los vasos, y los nodos mesentérica inferior se puede encontrar a lo largo de los vasos mesentéricos inferiores. Los ganglios linfáticos mesentéricos son fácilmente visibles en los animales delgados. Cuando son enterrados en la grasa mesentérica que a menudo dan un poco elevada, brillantez en el mesenterio suprayacente y pueden ser más de un color marrón más grisáceo que rodea a continuación, grasa mesentérica. Además, los ganglios linfáticos mesentéricos tienden a estar a lo largo de los vasos linfáticos y la vasculatura mesentérica. Una vez que se identifica un ganglio linfático, eliminar la sonda e inserte los fórceps Maryland trinquete en la cavidad abdominal. Usa los fórceps para captar el mesenterio adyacente al nodo de destino. Tire del mesenterio hacia el INCISion, y quitar el alcance de la cánula. Apague el insuflador y dejar abierta la llave de paso de la cánula para despresurizar el abdomen para facilitar la exteriorización del mesenterio. Tire del mesenterio exterior del cuerpo a través de la incisión. Una vez exteriorizado, sujete el mesenterio con pinzas hemostáticas curvas de mosquitos o fórceps pulgar para garantizar el acceso a través de la incisión. Identificar el nodo (s) de linfa en el mesenterio exteriorizada mediante la palpación para el ganglio linfático más firme y / o la visualización directa del color más gris o apariencia nodular del ganglio linfático. Una vez identificados, hacer una pequeña abertura (~ 3 – 5 mm) en el mesenterio cerca del nodo utilizando pinzas hemostáticas curvas. adjuntos gratuitos para el mesenterio mediante disección roma con las pinzas hemostáticas curvas. Ligar la vasculatura con sutura monofilamento 4-0 no absorbible como sea necesario. Utilice disección cortante con un escalpelo para eliminar el nodo de linfa. Coloque los nodos en Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640) enhielo. Examine el mesenterio exteriorizado de sangrado. Si se observa sangrado, proporcionar hemostasis apropiada mediante la oclusión de los vasos con pinzas hemostáticas o ligaduras (4-0 no absorbible monofilamento de sutura), o mediante el uso de cauterio. Soltar el mesenterio y insuflar el abdomen de nuevo a 10 – 12 mmHg para permitir que el mesenterio para volver a la cavidad abdominal. Repetir los pasos 2.4.1 a través de 2.4.8 para obtener biopsias de ganglios linfáticos adicionales. Biopsia hepatica Devolver la tabla a una posición horizontal. Colocar una cánula roscado en el abdomen a través de la incisión previamente utilizado para la recogida de la biopsia del ganglio linfático (incisión hecha en el paso 2.3.5). Asegúrese de que la incisión es lo suficientemente grande (~ de 5 – 7 mm) para permitir la colocación de la cánula sin la inserción del trocar. Insertar el endoscopio rígido a través de esta cánula hacia la cavidad abdominal craneal y visualizar el abdomen craneal y el hígado. Bajo visión de la cámara, inserte la biopsia forceps través de la cánula colocan previamente en el abdomen craneal izquierda (incisión hecha en el paso 2.3.1). Para obtener biopsias de hígado, colocar las pinzas de biopsia debajo del margen lóbulo hepático seleccionado con la parte móvil de la mandíbula hacia el hígado, abrir las pinzas, y permitir que el margen de caer en las mordazas abiertas. Asegúrese de que no epiplón es entre el hígado y fórceps de biopsia. Ajustar la posición del fórceps y cerrar el instrumento sobre la región de muestra deseado. Mantenga la presión durante aproximadamente 20 – 30 s para asegurar la hemostasia. Con las pinzas cerradas, retirar la muestra tirando suavemente las pinzas a través de la cánula. Esto rasgar suavemente la biopsia del hígado. Coloque las biopsias de hígado en medio RPMI 1640 en hielo. NOTA: El tamaño biopsia de hígado es de aproximadamente 5 mm x 2 mm x 2 mm utilizando 5 mm pinzas de biopsia. Examine el sitio de la biopsia para la hemorragia mediante la visualización de la cámara. Si se observa la hemorragia, coloque una solución salina moistened bastoncillo de algodón estéril a través de la cánula y se aplica presión a la zona de la biopsia. Alternativamente, el paquete de los sitios de la biopsia con espuma de gel estéril para ayudar a la hemostasia. Repetir los pasos 2.5.3 a través de 2.5.5 para obtener biopsias de hígado adicionales. NOTA: Aquí, se recogieron 3 biopsias por animal por procedimiento, que es suficiente para todos los análisis posteriores. Cierre quirúrgico Examinar la cavidad abdominal de sangrado. NOTA: Esto no ha ocurrido hasta la fecha. Sin embargo, si se observa sangrado excesivo, determinar el lugar de la hemorragia y proporcionar hemostasis apropiada a través de la presión con hisopos de algodón estériles o el uso de espuma de gel. Apague el insuflador y abrir las llaves de paso de la cánula. Aplicar presión manual suave al abdomen para despresurizar completamente la cavidad peritoneal. Retire las cánulas. Cierre cada una de las incisiones de la pared abdominal con 1 a 2 suturas interrumpidas simples por sitio. Se recomienda 4-0 sutura absorbible. Realizar un bloque chapoteo mediante la colocación de bupivacaína 0,1-0,3 cc en cada incisión para la analgesia local antes de cierre de la piel. Cierre la piel con 1 – 2 suturas interrumpidas enterrados (se recomienda 4-0 sutura absorbible) por sitio. goma de tejido se puede aplicar. 3. Hígado Procesamiento de biopsia y análisis de linfocitos Almacenar varios trozos de tejido hepático (aproximadamente 0,5 mm x 0,5 mm x 0,5 mm de tamaño) en tubos de crioconservación, en una solución de almacenamiento de ARN preferida, y 10% de formalina para el futuro molecular y análisis histológicos. Colocar las biopsias hepáticas restantes en 50 ml de RPMI 1640 suplementado con 1x penicilina / estreptomicina, 40 mg / ml de una solución de colagenasa comercialmente disponibles, y 4 mg / ml de ADNasa en un 250 ml vaso de plástico estéril con una tapa. Se agita vigorosamente usando una barra de agitación magnética y una placa de agitación durante 1 h a 37 ° C. Distribuir uniformemente vertiendo el tejido digerido. Gramoind el tejido digerido (de la etapa 3.1.1) más de dos 70 micras filtros encajan en dos tubos de 50 ml cónicos en una sola suspensión celular utilizando el extremo de un ml jeringa estéril 5. Llevar el volumen de ambos tubos de 50 ml en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino y 1x penicilina / estreptomicina (R10). Centrifugar las células a 840 xg durante 6 minutos a 4 ° C. Decantar el sobrenadante. Concentrar las células en un único tubo cónico de 50 ml mediante la suspensión de las células de ambos tubos en 5 ml R10 y combinar en una sola 50 ml tubo cónico. Se ajusta el volumen a 50 ml usando R10. Recuento de células utilizando un hemocitómetro para determinar el rendimiento celular. Centrifugar las células a 840 xg durante 6 minutos a 4 ° C. Resuspender las células en 1 ml de R10, distribuir de manera uniforme en dos 5 tubos de poliestireno ml de fondo redondo y llevar el volumen de cada tubo a 4 ml con R10, segmentación para> 500.000 células en cada tubo. Centrifugar las células a 840 xg durante 6 minutos a 4 ° C. Decantar los supernatant y resuspender el sedimento de células en 4 ml de tampón fosfato salino (PBS). Centrifugar a 840 xg durante 6 minutos a 4 ° C. Decantar el sobrenadante y resuspender las células en 100 l de PBS por agitación suavemente. Añadir 1,5 l de una mancha de células muertas puede arreglar. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Añadir los siguientes anticuerpos de tinción de superficie sin diluir en los títulos recomendados por el fabricante: CD45-PerCP (D058-1283 clon), CD3-PE-CF594 (clon SP34-2), CD20-PE-Cyanin5 (clon 2H7), CD4-BV605 ( OKT4 clon), CD8-BV570 (clon RPA-T8), y CD14-BV785 (clon M5E2). Se incuba a 4 ° C durante 20 min. Añadir 4 ml de PBS y centrifugar a 840 xg durante 6 minutos a 4 ° C. Decantar el sobrenadante y resuspender las células en 250 l de 1% de paraformaldehído en PBS. Precaución: El paraformaldehído es tóxico. Use equipo de protección personal adecuado. Analizar las poblaciones celulares utilizando un citómetro de flujo como se describe en la referencia 22.