공동 침강에 의한 F-actin에 대한 단백질 결합 측정

1. 자료 준비 관심 단백질을 정제하십시오 (2 절 참조). G-actin을 준비하거나 구입하십시오. 참고 : G – 굴지는 여러 소스에서 격리 될 수 있습니다 1 ; 양자 택일로, 그것은 구매 될 수 있습니다. 재구성 된 G-actin (5 mM Tris pH 8.0, 0.2 mM CaCl 2 , 0.2 mM ATP (adenosine triphosphate) 및 0.5 mM dithiothreitol (DTT))은 급속 냉동해야하며 -80 ° C 및> 10 mg / mL 작은 (10-20μL) 분취 량으로 사용하고 사용 직전에 해동합니다. G- 액틴 분취 량을 재 냉동해서는 ​​안됩니다. BSA와 같은 대조 단백질을 준비하거나 구입하십시오 (4.4 단계 참조). 10 배 중합 버퍼 (200 mM 이미 다졸 pH 7.0, 1M KCl, 20 mM MgCl 2 , 5 mM ATP 및 10 mM EGTA (에틸렌 글리콜 – 비스 (β- 아미노 에틸 에테르) -N, N, N ' 테트라 아세트산)). 필요한 경우 AOX를 첨가 한 후 10 배 재고를 만들고 pH를 조정하십시오. 분취 량 (25 μL는 유용한 부피입니다) 및 -80 & #176 ℃. 10x 반응 버퍼 (200mM 이미 다졸 pH 7.0, 1.5M NaCl, 20mM MgCl 2 , 5mM ATP 및 10mM EGTA)를 준비한다. 필요한 경우 AOX를 첨가 한 후 10 배 재고를 만들고 pH를 조정하십시오. 분주 량 (50-100 μL는 유용한 양) -80 ° C에서 보관하십시오. 참고 : 반응 완충액의 조성은 유연하며 배경 침전을 줄이고 비특이적 결합을 제한하고 결합을 개선하기 위해 조정해야 할 수도 있습니다 (1.5.1-1.5.3 단계). 단백질 안정성을 최적화하기 위해 반응 버퍼의 pH를 6에서 8 사이로 조정하십시오. 보다 낮거나 높은 pH에서 이미 다졸에 적절한 버퍼로 대체하십시오. 참고 : 안정성을 위해 단백질이 더 낮거나 높은 pH를 요구하지 않는 한, pH 7.0을 시작점으로 사용하십시오. pH가 6.0 이하이거나 8.0 이상인 완충액을 사용하지 마십시오. 악틴이 파괴 될 수 있습니다. 권장 버퍼 (최종 농도 및 나열된 최적의 pH)는 다음과 같습니다 : 20 mM MOPS (3- ( N- 모르 폴리 노) 프로판 술폰산), pH= 6.5; 20 mM 이미 다졸, pH = 7.0; 10 mM HEPES (4- (2- 하이드 록시 에틸) 피페 라진 -1- 에탄 술폰산), pH = 7.5; 및 20 mM 트리스, pH = 8.0. 분석의 필요에 따라 반응 완충액의 염 농도를 변경하십시오. 참고 : 액틴은 산성 단백질이며 거의 모든 액틴 결합 단백질은 액틴과 결합하는 정전 기적 상호 작용에 어느 정도 의존합니다. 따라서 소금 농도를 높이면 대부분의 경우 액틴 결합이 감소합니다. 반응 완충액은 생리 학적 수준의 염 (150 mM NaCl, 작업 농도)을 사용하며, 이는 권장되는 출발점입니다. 필요한 경우, 염 농도는 결합을 촉진시키기 위해 낮추거나 ( 예 : 100 mM) , 결합을 제한하기 위해 증가시킬 수 있습니다. 특별한 이유가 없으면 반응 완충액에서 MgCl 2 , ATP 또는 EGTA의 농도를 변경하지 마십시오. 2. Assay를위한 Test Protein 준비 준비최고의 결과를 얻기 위해 액체 크로마토 그래피를 사용하는 고순도 단백질 7 . 참고 : 재조합 단백질을 사용하는 경우 글루타티온 -S- 트랜스퍼 라제 (GST)와 같은 대형 단백질 태그는 바인딩을 방해 할 수 있으므로 대상 단백질에서 프로테아제 절단으로 제거해야합니다. GST는 또한 융합 단백질의 동종이 량체 화를 유발하여 인위적으로 액틴 결합 친화도를 증가시킬 수 있습니다. 280 nm에서 흡광도를 측정하여 단백질 농도를 결정하십시오. 소멸 계수로 나눕니다. 소멸 계수는 서열 분석 또는 온라인 도구를 사용하여 단백질 서열로부터 계산 될 수있다. 또는 Bradford 또는 BCA (bicinchoninic acid) 방법을 사용하여 단백질 농도를 결정하십시오. 참고 : 초기 실험의 경우 일반적으로 20-40 μM의 단백질 50-100 μL로 충분합니다. 이것은 대부분의 액틴 결합 단백질에 유용한 출발점 인 낮은 마이크로 몰 범위에서의 결합 분석을 허용합니다. 큰 콴친화력을 계산하기위한 결합 곡선을 생성하기 위해서는 단백질 농도가 더 높아야한다 (5 절 참조). 사용 직전에 단백질을 하드 스핀 (4 ℃에서 50,000-100,000 xg, 10 분간)하여 불용성 단백질의 응집체를 제거합니다. 용해도가 중요한 경우 원심 분리 후 단백질 농도를 다시 측정하십시오 (2.2 단계). 3. F – 굴지 준비 -80 ° C의 냉동고에서 G-actin 분취를 제거하고 신속하게 해동하십시오. G- 액틴에 10x 중합 버퍼를 첨가하여 최종 농도를 1x로 만든다. 1x 중합 버퍼의 G- 액틴 농도가 임계 농도보다 훨씬 높은 적어도 10-20 μM인지 확인하십시오. 액틴이 중합되도록 실온 (RT)에서 1 시간 동안 품어 낸다. 중합 후 F-actin을 4 ℃에서 용액으로 보관하십시오. 몇 주 동안 안정합니다. 보관 후에 F-actin을 다시 사용하기 전에 부드럽게 뒤집습니다또는 튜브를 여러 번 가볍게 두드리면 모든 액틴이 용해되고 용액에 균일하게 분포됩니다. 참고 : (선택 사항) phalloidin을 첨가하여 G-actin : phalloidin의 1 : 1 몰 비율을 달성하십시오. Phalloidin가 F – 굴지에 바인딩 수 있도록 RT에서 30 분 품어. Phalloidin은 F-actin을 안정화시키고 두 가지를 수행합니다 : (i) 원심 분리 중에 침전하지 않는 actin의 양을 줄이고 (ii) F-actin을 임계 농도 (~ 0.5 μM) 미만으로 희석 할 수 있습니다. 결합 곡선을 생성하기 위해 F- 액틴의 양을 변화시키는 경우에 필요하다 (친화도 측정에 관한 섹션 5 참조). 4. Pelleting Assay – 기본 프로토콜 참고 : 4 장에서 설명 된 기본 프로토콜은 관심 단백질이 F-actin과 함께 침전물인지 여부를 결정하는 데 사용됩니다. 일단 F- 액틴에 대한 결합이 확립되면,이 상호 작용의 친화력은 제 5 장에서 기술 된 프로토콜에 따라 측정 될 수있다. 10x 주식을 1x로 희석하여 사용 일에 반응 완충액을 준비하고 DTT를 1mM의 최종 농도로 첨가한다. 참고 : (선택 사항) 폴리 디카 놀을 반응 완충액에 0.02 %의 최종 작업 농도로 첨가한다. Polidocanol은 비특이적 백그라운드 결합을 줄이고 소수성 단백질이 초 원심 분리 튜브에 달라 붙지 않도록하는 계면 활성제입니다. ultracentrifuge 튜브에 1X 반응 버퍼에서 원하는 농도로 관심의 단백질을 희석. 작은 최소 부피의 초 원심 분리 튜브 ( 예 : 각각 0.2 mL를 담는 7 x 20 mm 튜브)를 사용하여 다량의 단백질을 사용하지 않으려면 샘플 볼륨을 낮게 (40-60 μL) 유지하십시오. 참고 : 많은 액틴 바인딩 단백질은 마이크로 몰 범위의 F – 굴지에 대한 친화력을 가지고 있기 때문에 2와 10 μM에서 관심 단백질을 테스트하는 것이 좋습니다. 10 μM에서 결합이 관찰되지 않으면 높은 농도에서 결합이 관찰되지 않을 수 있습니다. 만약첨가 된 단백질이 최종 반응 부피의 10-20 % 이상을 차지한다면, 실험을 수행하기 전에 단백질을 반응 완충액으로 투석 할 필요가있다. 원하는 최종 농도에 F – 굴지를 추가합니다. 참고 : 2 μM은 임계 농도보다 훨씬 높기 때문에 초기 실험에 유용한 농도입니다. 따라서 섬유 상태의 액틴을 SDS-PAGE (단계 4.10)로 분석 할 때 보이는 펠렛을 생성합니다. 분석을 유익하게 만들기 위해 초 원심 분리기 튜브에서 다음 컨트롤을 준비하십시오. F – 굴지없이 관심 단백질을 포함하는 샘플을 준비합니다. 이 샘플에서 단백질의 농도가 "플러스 F- 액틴"샘플의 농도와 일치하는지 확인하십시오. 참고 :이 샘플은 F-actin의 부재하에 초 원심 분리 튜브의 측면에 응집되거나 붙어있는 단백질의 양을 결정합니다. 음성 대조 샘플 준비관심 단백질에 사용 된 농도와 동일하거나 유사한 농도로 측정한다. F-actin의 유무에 관계없이 F-actin에 결합하지 않는 대조군 단백질을 사용하십시오. 참고 : 단백질은 F-actin에 결합하지 않더라도 액틴 필라멘트와 펠렛에서 F- 액틴으로 "갇히게"될 수 있기 때문에 이것은 중요한 조절입니다. 포집 양은 F- 액틴 공급원, 완충액 조건 등에 따라 다를 수있다 . 따라서,이 대조군은 모든 실험에 포함되어야한다. 이상적으로, 대조 단백질은 해당 단백질과 유사한 분자량을 가져야한다 ( 예 : αE-catenin (~ 100 kDa), BSA (66 kDa)가 적절한 대조군 임). 상업적으로 이용 가능한 겔 여과 표준은 크기의 범위를 커버하고 응집체를 함유하지 않기 때문에 우수한 대조 단백질을 만든다. 선택적으로 F-actin의 유무에 관계없이 F- 액틴에 결합하는 단백질을 포함하는 양성 대조 시료를 준비하십시오. 농도가 th와 유사한 지 확인하십시오.관심있는 단백질. 참고 :이 컨트롤은 실험 조건 ( 예 : 준비된 F- 액틴, 반응 완충액 및 원심 분리)이 F- 액틴 결합을 허용한다는 것을 입증한다는 점에서 유용합니다. 펠렛 화 분석은 약한 F- 액틴 상호 작용을 발견하지 못하기 때문에 (Discussion 참조), 알려진 F- 액틴 결합 단백질은 F- 액틴에 대해 보통 내지 약한 친 화성을 갖는 것이 권장된다 ( 즉, 낮은 마이크로 몰 범위 ). 정제 된 F- 액틴 결합 단백질은 상업적으로 이용 가능하다. 모든 샘플을 RT에서 30 분 동안 인큐베이션하십시오. 참고 : 관심의 대상이되는 단백질이 안정되어 있다고 가정 할 때,보다 긴 배양 시간은 괜찮습니다. 해당 단백질이 실온에서 안정적이지 않으면 시료를 4 ° C에서 배양 할 수 있습니다. 이 경우보다 긴 배양 시간이 필요할 수 있습니다. 시료를 원심 분리기 로터에 넣으십시오. 원심 분리 후 펠렛 재현을 돕기 위해 튜브를 로터 안에 위치시킵니다.이를 위해 원심 분리기 튜브 ( 예 : 샘플 번호)를 표시하고 회 전자의 모든 튜브를 동일한 위치 ( 예 : 밖으로 향하는 번호)에 배치하십시오. 초 원심 분리기에서 4 ° C에서 20 분 동안 100,000 xg에서 원심 분리하십시오. 원심 분리 후 각 튜브에서 상등액 3/4 ( 예 : 초기 용량이 60 μL 인 경우 45 μL)을 제거하고 별도의 미세 원심 분리 튜브에서 4 배 샘플 버퍼 (이 경우 15 μL)의 1/3 부피로 혼합합니다. 펠렛을 방해하지 않도록 조심스럽게 겔 – 로딩 팁으로 남아있는 상층 액을 제거하십시오 (유리 점으로 보일 수 있음). 참고 : 단백질 분해 후 분리를 제한하기 위해 원심 분리가 끝난 후 최대한 빨리 튜브에서 뜨는 물질을 제거하는 것이 중요합니다. 또한 동일한 이유로 반응 완충액으로 펠렛을 씻지 마십시오. 각 pelle에 1x 샘플 버퍼의 4/3 볼륨 추가t ( 예 : 시작 부피가 60 μL 인 경우 80 μL). 참고 : 이것은 펠릿과 뜨는 샘플 사이의 직접적인 비교와 pelleted 단백질의 비율의 결정을 허용, 뜨는 (단계 4.8, 4x 샘플 버퍼의 1/3 볼륨이 추가되었습니다)에 대한 것과 같은 희석을 만듭니다. 모든 튜브에 샘플 버퍼를 추가하고 RT에서 적어도 5 분 동안 품어 라. 샘플 회수를 향상시키기 위해 펠렛을 샘플 버퍼에 놓습니다. 튜브의 펠렛 영역을 연속적으로 씻어서 펠렛을 resuspended p200 피펫 팁으로 샘플 8-10 번 씹다. resuspension과 도움이 trituration 동안 펠렛 위에 부드럽게 피펫 팁을 긁어. 참고 : 분쇄 중에 시료에 공기가 들어 가지 않도록주의하십시오. 시료 버퍼가 거품을 일으키고 시료 회수가 줄어들 수 있습니다. 분쇄 후 microusuge 튜브에 resuspended 샘플을 전송하십시오. </ ol> SDS-PAGE 및 Coomassie 염색법 8 에 의해 상등액과 펠렛 시료를 분석하고 레인 당 10-15 μL의 시료를 넣는다. 이것은 단백질을 시각화하기에 충분합니다. 참고 : F- 액틴과 함께 침강하는 단백질은 "F- 액틴 없음"펠릿 샘플 ( 그림 1A )을 통해 "플러스 F- 액틴"펠렛 샘플에서 농축됩니다. 표준 Coomassie blue 염색은 단백질 농도가 0.1 ~ 10 μM 범위에 있다면 검출에 충분합니다. Colloidal Coomassie 9 또는 Western blotting을 사용하면 단백질 농도를 낮추어 고친 화도 상호 작용을 측정 할 때 민감도를 높일 수 있습니다. 스캐너 또는 이미징 시스템을 사용하여 이미지 쿠마시 염색 젤 (단계 5.12). 5. Pelleting Assay – 정량화 참고 : F – 굴지에 대한 특정 바인딩이 관찰되면 t의 친화력을 측정하는 것이 유용 할 수 있습니다그는 상호 작용합니다. 이것은 제 4 장에서 개괄 된 프로토콜을 약간 변경하고 추가함으로써 이루어집니다. 결합 분석을 설계하고 해석하는 훌륭한 지침서는 Pollard 10을 보십시오. 분석 및 정량화를 돕기위한 흐름도 ( 그림 2 )가 제공됩니다. 시험 할 농도 범위를 결정하십시오. 참고 : 농도 범위는 단백질에 따라 달라지며 겉보기 K d ( 예 : 1 μM) 미만의 농도에서 결합을 포화시킬만큼 높은 농도까지 확장해야합니다. 바인딩이 정확한 결합 곡선을 생성하기 위해 농도 범위의 하이 엔드에서 여러 샘플에서 포화에 도달하는 것이 중요합니다 ( 그림 1C ). 위에서 언급했듯이 많은 액틴 결합 단백질은 낮은 마이크로 몰 범위 (1-5 μM)에서 F- 액틴에 대한 친 화성을 가지고 있습니다. Kd가 0.5-1μM 인 단백질의 경우 유용한 출발 농도 범위는 0.1-10 μM. 응집체를 제거하기 위해 관심있는 단백질을 강하게 스핀 (2.3 단계). 시험 할 최종 농도의 2 배에서 7-8 샘플을 함유하는 농도 시리즈를 만들기 위해 단백질을 순차적으로 희석하십시오. 예를 들어, 시험 할 범위가 0.1-8 μM이라면 1 배 반응 완충액 (16, 8, 4, 2, 1, 0.5 및 0.2 μM)에서 다음 희석액을 준비하십시오. 참고 : 4.2 단계에서 언급했듯이 추가 된 단백질이 첫 번째 희석 물의 10 % -20 % (위의 예에서 16μM 샘플)를 구성하는 경우 단백질을 더 농축하거나 단백질을 1x 반응 완충액에 첨가 하였다. "F- 액틴 플러스"와 "F- 액틴 없음"샘플을 위해 각 희석액을 충분히 준비하십시오. 초 원심 분리 튜브에서 1X 반응 완충액으로 원하는 단백질을 희석하여 시료를 준비합니다 (4 절과 동일). ultracent를 사용하여 다량의 단백질을 사용하지 않도록 샘플 볼륨을 낮게 유지하십시오 (40-60 μL).작은 최소 용량 ( 예 : 각각 0.2 mL를 담는 7 x 20 mm 튜브)의 소성 튜브. 적절한 최종 농도에 F – 굴지를 추가하고 1x 반응 버퍼를 사용하여 부피를 높입니다. 예를 들어 2 μM F-actin을 사용하는 50 μL 반응의 경우 각 샘플에 2 x 단백질 25 μL, 10 μM F-actin 10 μL 및 1x 반응 완충액 15 μL가 있는지 확인하십시오. 대조 샘플을 포함시킨다 (4.4.2 및 4.4.3 단계). 참고 : 음성 대조군과 양성 대조군의 경우, 범위의 중간에서 상단까지 이상적으로 ( 예 : 농도 범위가 0.1-10 μM 인 경우 4 μM) 테스트 할 범위 (단계 5.1)에서 하나의 농도를 사용하십시오. 모든 샘플을 RT에서 30 분 동안 인큐베이션하십시오. 30 분 후 각 시료의 1/5 ( 예 : 50 μL 반응 10 μL)을 제거하고 20 μL의 물과 4 μM 시료 완충액 10 μL와 혼합합니다. 참고 : 이들은 "합계"입니다.표준 곡선을 생성하는 데 사용됩니다. 초 원심 분리기 로터에 샘플을로드하십시오. 100,000 xg 및 4 ° C에서 20 분간 원심 분리하십시오. 선택적으로, 원심 분리 후, 각 튜브에서 상등액의 3/4 ( 예 : 원심 분리 된 부피가 40 μL 인 경우 30 μL)을 제거하고 4x 샘플 버퍼 (이 경우 10 μL)와 별도의 미세 다공 튜브로 혼합하십시오. 펠렛을 방해하지 않도록 조심스럽게 젤 -로드 팁으로 남아있는 뜨는을 제거합니다. 참고 : 결합 친화도를 측정 할 때 상등액을 실행할 필요가 없습니다. 그럼에도 불구하고 특히 새로운 단백질을 시험 할 때 상층 액을 저장하는 것이 유용 할 수 있습니다. 분석하지 않는 경우 뜨는 부분을 제거하십시오 (단계 5.7). 1x 샘플 버퍼 ( 예 : 원심 분리 된 볼륨 40 μL 경우 40 μL)의 1 볼륨에 펠렛을 Resuspend. 모든 튜브에 샘플 버퍼를 추가하고 RT에서 적어도 5 분 동안 품어 라. Trp200 피펫 팁으로 샘플을 8-10 회 반복하여 튜브의 펠렛 부위를 계속 씻어냅니다. resuspension과 도움이 trituration 동안 펠렛 위에 부드럽게 피펫 팁을 긁어. resuspended 단백질을 microcentrifuge 튜브에 옮기십시오. 참고 : 이들은 "Pellet"샘플입니다. 총 및 펠렛 샘플을 SDS-PAGE로 분석하십시오. 8 . 가능한 경우 모든 젤을 하나의 젤로 실행하십시오. 그렇지 않다면 한 겔에서 펠렛 샘플을 실행하고 두 번째 젤에서 전체 샘플을 실행하십시오. 참고 : 샘플 수를 고려할 때 분석을 위해 대형 젤 시스템을 사용하는 것이 좋습니다. 2 개 이상의 젤에서 샘플을 실행하는 경우 모든 젤을 동일하게 염색해야합니다 ( 예 : 동일한 쿠마시 용액과 얼룩 / 염색시 동일한 시간). Image Coomassie로 염색 된 젤은 넓은 범위 ( 즉, 2 ~ 3 로그) 및 선형 범위에서 단백질 밴드 강도를 측정하는 이미징 시스템을 사용합니다. 이미지가포화 된 픽셀없이 수집됩니다. 참고 : 레이저 기반 이미징 시스템은 최상의 감도 및 신호 대 잡음비를 제공합니다. ImageJ 또는 유사한 분석 프로그램을 사용하여 단백질 밴드 강도를 측정하고 결합 된 단백질의 양을 계산합니다. 참고 : 모든 샘플 측정에 대해 ImageJ의 선택 도구를 사용하여 각 밴드 주위에 관심 영역 (ROI)을 그리고 영역과 평균 회색 값을 측정 (분석> 측정)합니다. 샘플이없는 영역에서 평균 회색 값을 측정하여 각 젤의 배경을 계산합니다. 각 ROI 평균 회색 값에서 배경 평균 회색 값을 뺀 다음 영역을 곱하여 각 대역의 통합 밀도 값을 얻습니다. 총 샘플 ( 그림 2A )에서 관심 밴드 강도의 단백질을 측정합니다. 밴드 강도 ( 즉, 통합 밀도 측정) 대 단백질 질량 ( 그림 2 )을 플로팅하여 표준 곡선을 생성하십시오.2B). F- 굴지 (co-sedimented protein, 그림 2C )와 함께 침전 된 관심 단백질의 양을 측정하십시오. F-actin의 부재하에 침전 된 관심 단백질의 양을 측정하십시오 (백그라운드 침강, 그림 2D ). 공 침강 단백질에서 배경 침전물을 뺀다 ( 즉, 5.13.3 단계의 5.13.4 단계의 값을 빼서 F- 액틴에 결합하는 단백질의 양을 결정한다). 각 펠릿에서 F – 굴지의 양을 측정하십시오 ( 그림 2E ). 샘플 당 F- 액틴의 평균 양을 결정한 다음 각 샘플을 평균으로 나누어 각 샘플의 F- 액틴 비율을 평균 ( 즉, 밴드 아래 숫자)과 비교하십시오. 각 샘플에 대해 펠렛의 차이를 조정하기 위해 F- 액틴 액틴 펠릿 비율 (단계 5.13.6)에 의해 결합 단백질 (단계 5.13.5에서 계산)의 양을 나누십시오. 엔OTE :이 값은 표준화 된 결합 단백질입니다. 각 시료에서 표준화 된 결합 단백질 (단계 5.13.7)의 양 (질량)을 계산하기 위해 표준 곡선 (단계 5.13.2)을 사용한다. 참고 : 처음에 제거 된 단백질 ( "총"시료)과 적재 된 양 (전체 펠렛이 적재되지 않은 경우 펠릿의 일부분 일 것임)은 단백질의 총량을 계산할 때 고려되어야합니다 그 펠렛. 펠렛 (단계 5.13.8에서 계산)의 단백질 총 질량과 샘플의 부피로부터 각 샘플에서 결합 된 단백질의 농도를 결정하십시오. 자유 단백질의 양을 결정하기 위해 시작 농도에서이 값을 뺍니다. 결합 된 단백질의 농도를 액틴의 농도 (액틴의 μM / μM)로 그리고 플롯 대 자유 단백질의 농도를 나누어서 결합 곡선을 만듭니다 ( 그림 1C ). 참고 : F-actin은 단일의 균일 한 종 (species)이 아니기 때문에 diffi-G- 액틴 농도로부터 F- 액틴의 몰 농도를 외삽 법으로 계산한다. 시작 G- 액틴 농도를 사용하여 결합 된 단백질의 양 (μM / 액틴 μM)을 결정하고 반응에서 결합 부위의 겉보기 농도를 추정하십시오. 결합 부위의 농도는 일반적으로 모든 악틴이 중합되지 않기 때문에 단일 액틴 결합 단백질 분자가 액틴 필라멘트상의 여러 모노머와 접촉 할 수 있기 때문에 반응에서 액틴 단량체의 농도보다 낮습니다. 통계 프로그램을 사용하여 비선형 최소 제곱 회귀 (nonlinear least-squares regression)를 사용하여 결합 곡선으로부터 친 화성 (K d ) 및 B max 를 결정합니다. 참고 : 바인딩 데이터를 분석하기 위해 스 캐터드 플롯을 사용하지 않는 것이 좋습니다. 부분적으로 바인딩이 포화되었는지 여부가 불분명 해지고 실험적 오류 10 을 왜곡 할 수 있기 때문입니다.