L'utilisation d'un PCR-capillaire fluorescent Gel Electrophoresis Technique pour Génotype CRISPR / cas9 médiation Knockout Mutants dans un format à haut débit
Summary
La technique de génotypage décrit ici, qui couple de réaction en chaîne par polymérase fluorescente (PCR) à une électrophorèse sur gel capillaire, permet de génotypage à haut débit des clones knock-out à médiation par nuclease. Il évite les limitations rencontrées par d'autres techniques de génotypage et est plus rentable que les méthodes de séquençage.
Abstract
Le développement d'outils d'édition programmables génome a facilité l'utilisation de la génétique inverse pour comprendre les rôles des séquences génomiques spécifiques jouent dans le fonctionnement des cellules et des organismes entiers. Cette cause a été aidé énormément par l'introduction récente du système un CRISPR / cas9 outil polyvalent qui permet aux chercheurs de manipuler le génome et du transcriptome afin, entre autres, assomment, abattre ou frapper dans les gènes dans une cible manière. Dans le but de frapper sur un gène, CRISPR / cas9 médiée cassures double brin recrutent la voie de réparation de l'ADN d'assemblage terminal non homologue pour introduire l'insertion du cadre de lecture à l'origine ou la suppression de nucleotides au niveau du site de coupure. Cependant, un ARN de guidage individuel peut entraîner des effets indésirables hors cible, et pour écarter ces derniers dehors, l'utilisation des ARN guides multiples est nécessaire. Cette multiplicité des cibles signifie également qu'un criblage à haut volume de clones est nécessaire, ce qui soulève l'utilisation d'un efFicient technique à haut débit pour le génotype des clones knock-out. techniques de génotypage actuelles soit souffrent de limitations inhérentes ou entraînent des coûts élevés, les rendant donc impropre à des fins à haut débit. Ici, nous détaillons le protocole pour l'utilisation de la PCR fluorescente qui utilise l'ADN génomique à partir d'un lysat cellulaire brut sous forme d'un gabarit, puis la résolution des fragments de PCR par électrophorèse sur gel capillaire. Cette technique est suffisamment précis pour différencier une différence de paire de bases entre les fragments et est donc suffisante pour indiquer la présence ou l'absence d'un cadre de lecture dans la séquence codante du gène ciblé. Cette connaissance précise empêche effectivement la nécessité d'une étape de séquençage de confirmation et permet aux utilisateurs de gagner du temps et des coûts dans le processus. De plus, cette technique est avérée être polyvalent dans génotypage diverses cellules de mammifères de diverses origines de tissus ciblés par les ARN de guidage contre de nombreux gènes, comme le montre ici et ailleurs.
Introduction
approches de génétique inverse ont permis aux scientifiques d'élucider les effets des altérations spécifiques dans le génome de la cellule ou organisme entier. Par exemple, l'expression d'un gène particulier peut être atténué par le gène knock – down 1, 2 (réduction partielle) ou knock – out de gène 3, 4 (ablation complète) afin de déterminer l'effet que cela a sur la fonction de la cellule ou sur la développement de l'organisme.
expériences de knock-out de gène sont devenues plus faciles depuis l'introduction des nucleases spécifiques de séquences programmables, tels que des nucléases doigt de zinc (ZFN) et la transcription des nucléases effectrices de type activateur (TALENS). Cependant, la caractérisation relativement récente du CLUSTERED régulièrement entrecoupés de courte répétition palindromique (CRISPR) / système cas9 a rendu extrêmement facile pour tout laboratoire dans le monde entier pour effectuer genexpériences e knock-out. En substance, le CRISPR / système cas9 se compose de deux composants essentiels d'un ARN de guidage unique (ARN sg), qui reconnaît et se lie par l'intermédiaire d'une complémentarité de base à une séquence spécifique dans le génome, et une endonucléase appelé cas9. Le lendemain de la liaison spécifique et de l'action du complexe ARN sg-cas9 sur l'ADN génomique est le clivage double brin de l'ADN. Ceci, à son tour, déclenche le mécanisme de réponse aux dommages de l'ADN dans la cellule, qui est ensuite réparé par l'intermédiaire des voies d'extrémité d'assemblage non homologues (NHEJ) ou la recombinaison homologue (RH). Le mécanisme de réparation NHEJ (mais pas le mécanisme des ressources humaines) se traduit souvent par l'insertion aléatoire ou la suppression des nucléotides sur le site de réparation, ce qui entraîne des mutations d'insertion / délétion (indels), il peut provoquer le cadre de lecture d'un exon à passer. Cela peut alors entraîner le knock – out du gène en raison de la fin prématurée de la traduction et la carie médiation non – sens 5, 6,7.
En dépit de la mise en pratique offerte par l'introduction du CRISPR / système cas9 en assommant un gène, le génotypage des clones de cellules cibles reste un goulot d' étranglement, en particulier dans un haut débit 8, 9. Les techniques existantes, soit souffrent de graves limitations inhérentes ou sont financièrement coûteuses. Par exemple, le géomètre ou un dosage T7E1, qui est un essai enzymatique qui détecte des mésappariements de l'ADN duplex 10, ne sont pas en mesure de distinguer entre les clones de type sauvage et des mutants homozygotes (clones dont les allèles sont mutés de manière identique), étant donné que ces clones ont des alleles identiques et donc ne présentent pas de mésappariements dans leur séquence d'ADN 11. De plus, l'utilisation du séquençage Sanger, qui est considéré comme l'étalon-or dans le génotypage des clones mutants, dans une configuration à haut débit est indésirable en raison de son coût élevé. Nous présentons ici un detailed protocole de la technique d'électrophorèse sur gel capillaire PCR-fluorescent, qui peut contourner les limitations des autres techniques de génotypage existantes et est particulièrement utile pour effectuer un criblage à haut débit des clones knock-out à médiation par nuclease. Cette méthode est techniquement simple à réaliser et de gagner du temps et de coût.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le assommant d'un gène spécifique dans une lignée cellulaire modèle de choix est devenu habituel pour élucider le rôle que le gène joue dans ce contexte cellulaire particulier. En fait, plusieurs écrans à l' échelle du génome sont actuellement disponibles qui utilisent le système de CRISPR / cas9 pour cibler des gènes humains pratiquement tous connus dans le génome 14, 15, 16. Avec ces écrans à grande é…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Mme Tan Shi Min, Mme Helen Ong, et le Dr Zhao Yi pour aider avec les expériences d'électrophorèse sur gel capillaire. Ce travail a été soutenu par NMRC / IRG accorder NMRC / 1314/2011 et MOE ACRF Niveau 2 subvention du Fonds MOE2011-T2-1-051.
Materials
| HEPG2 cells | ATCC | HB-8065 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30022.01 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SV30160.03 | |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid | Addgene | PX458 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| HyClone Water, Molecular Biology Grade | GE Healthcare | SH30538.02 | |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3' |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3' |
| Unlabeled PCR amplification forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles |
| 6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| HEX-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| Unlabeled PCR reverse primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3' |
| Taq PCR Core Kit | QIAGEN | 201223 | |
| Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320 | |
| GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard | Thermo Fisher Scientific | 4322682 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | 4405633 | |
| 3500 Series 2 program | Thermo Fisher Scientific | 4476988 | |
| Gene Mapper 5 program | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | |
| Gentra Puregene Cell Kit | QIAGEN | 1045696 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| NAP1L1 Antibody (N-term) | Abgent | AP1920b | |
| Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10] | GeneTex | GTX70220 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 |
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