Ca Cortical Multi-capa²⁺ Imágenes en ratones con movimientos libres con sondas de prisma y microscopía de fluorescencia miniaturizada

Los procedimientos que involucran sujetos animales han sido aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucionales (IACUC) en LifeSource Biomedical Services, NASA Ames Research Center, California. 1. Preparación preoperatoria Esterilice las herramientas que se utilizarán en los procedimientos quirúrgicos en un esterilizador de cuentas calientes y limpie el área de la cirugía con etanol al 70%. Encienda la almohadilla calentadora colocada sobre la etapa estereotáxica y manténgala a 37 ° C. Anestesiar al animal con isoflurano (5% para la inducción, y 1-2% para el mantenimiento, 0.6-0.8 L / min O 2 ). Compruebe la ausencia de un reflejo pinchazo para determinar la profundidad de la anestesia. Montar el animal en un marco estereotáxico equipado con barras de oreja y dientes. Aplique un ungüento oftálmico en los ojos del animal y cúbralos con un pedazo de papel oscuro para protegerlos del secado e intensas luces quirúrgicas. Inyectar el animal por vía subcutánea con cetoprofeno (2,5Mg / kg) o carprofeno (2,5 mg / kg) 2. Cirugía de inyección de virus Recortar y afeitar el cuero cabelludo entre los ojos y las orejas y desinfectar la piel con 3 hisopos alternativos de etanol al 70% y betadina. Exponer el cráneo haciendo una incisión en el cuero cabelludo, comenzando entre los ojos y extendiéndose 1,5 cm rostrocaudal con una hoja quirúrgica estéril. Abra la piel para exponer el cráneo y retire el periostio alrededor del sitio de inyección deseado usando hisopos de algodón y un bisturí. Enjuague el cráneo con PBS estéril. Limpiar y pulir el cráneo con hisopos de algodón. Nivel del cráneo, y con un marcador, marcar las coordenadas estereotáxicas para la inyección de virus. Usando una fresa de 0,5 mm en un microdrill de alta velocidad (establecido a alrededor de 7.000-10.000 rpm), crear un pequeño agujero en el cráneo. Aplique una ligera presión durante la perforación y limpie intermitentemente el polvo de hueso y humedezca el área con PBS estéril para evitar que el tejido cerebral sobrecaliente, hasta que la superficie del cerebro estéDolido Mantenga el cerebro húmedo donde se perfora el agujero. Use una aguja de 26 G para recoger virus ( por ejemplo, AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) en la microjeringe, y luego reemplazarla con una aguja de 35 G para inyección. Conecte la microjeringe cargada con virus al brazo manipulador del aparato estereotáxico. Lleve la jeringa cerca del agujero del sitio de inyección y ajuste el ángulo de la aguja para que entre en un ángulo de 90 ° con respecto a la superficie del cerebro. Baje la aguja hasta que toque pia mater y perfore a través de la duramadre. Comience a bajar la aguja en incrementos de 10 μm / s hasta que alcance la profundidad deseada (z). Fijar la localización de la aguja allí usando el brazo estereotáxico. Coloque la bomba de microjeras para inyectar 250 nL de virus a 25 nL / min. Paso crítico: Dado que el volumen del virus a inyectar depende del título y la dilución, ejecute los experimentos de dilución de antemano, para establecer el volumen óptimo y los criterios de concentración para las células de imagenEn el experimento. Si se ve algún virus exudado fuera del sitio de inyección, haga una pausa en la inyección y espere hasta que el tejido cerebral absorba la caída del virus. Espere 5-7 minutos después de inyectar el volumen total antes de retraer la aguja. Los colorantes como el verde rápido también se podrían agregar a la solución del virus para ayudar a controlar la tasa de inyección en el caso de que el virus se ve exudado fuera de la superficie del cerebro. Para etiquetar múltiples capas en la corteza, use inyecciones múltiples si es necesario. Comienza primero en el sitio más ventral, esperando 5-7 min después de la inyección y tirando de la aguja hasta el siguiente punto más dorsal para inyección ( por ejemplo, inyectar a -1,0 mm AP, 1,5 mm ± ML y 400 y 600 μm DV). Espere 10 minutos después de la inyección final antes de extraer la aguja y retirarla de la disposición estereotáxica. Mezcle una pequeña cantidad de un adhesivo de elastómero transparente biocompatible in vivo de la jeringa de doble cilindro (Por ejemplo Kwik-Sil) y cubrir el agujero en el cráneo con él. Aplique adhesivo de cianoacrilato en la parte superior de la capa de adhesivo de elastómero y deje que cure. Suturar el cuero cabelludo y permitir que el animal para recuperarse de la anestesia en una jaula de recuperación de calor hasta que es ambulatorio. Administrar ketoprofeno (2,5 mg / kg) o carprofeno (2,5 mg / kg) por vía subcutánea antes de devolver el animal a su jaula de origen. Singularmente casa después de la cirugía los sujetos para proteger el sitio de la cirugía y repetir la dosis 24 horas después. Después de retirar la microjeringe, enjuague las agujas de 26 G y 35 G 7-10 veces con agua destilada para limpiar antes de guardarlo. 3. Cirugía de Implante de Sonda de Prisma 1-2 semanas después de la inyección del virus, se preparan para la cirugía del implante de la sonda del prisma. Desinfecte la sonda de prisma en etanol al 70% y límpiela con papel para lentes. Inserte la sonda de prisma en la herramienta porta-lente y apriete el tornillo hexagonal con el destornillador. Asiente el microscopio en el soporte de la base (elLos imanes lo tendrán en su lugar). Prepare el animal como se describe en la sección Preparación preoperatoria. Recortar y afeitar la cabeza del animal entre los ojos y las orejas y desinfectar la piel con hisopos alternos de etanol al 70% y betadina. Exponer el cráneo mediante la incisión de la piel con un par de tijeras estériles y retirar el colgajo cutáneo y periostio subyacente. Secar y pulir el cráneo con hisopos de algodón. Asegúrese de quitar adecuadamente el tejido muscular circundante para crear una base de hueso amplia, limpia y seca, en preparación para los siguientes pasos. Implante los tornillos del cráneo en el hemisferio contralateral para hacer el implante estable y seguro. Estos también pueden ser útiles si se elige implantar un cabezal para la fijación de cabeza despierta para preparar al animal para sesiones de imágenes experimentales en la Sección 5. Nivele el cráneo y marque con un marcador las coordenadas AP y ML para la inserción de la lente. El uso de una rebaba de 0,5 mm en un microdrill abre una craneotomíaEl diámetro de la craneotomía es sólo mayor que el diámetro del prisma, es decir 1,0 mm en este caso. Taladre suavemente mientras hace una pausa intermitente para enjuagar el cráneo con PBS estéril y succionar con hisopas de algodón. Retire el polvo de hueso que se genera. Paso crítico: Colocar la craneotomía de tal manera que cuando el prisma se inserta en la corteza, su borde plano (superficie de imagen) se enfrenta al sitio de inyección del virus y se encuentra dentro de un radio de 150-200 μm. Deje de perforar justo antes de que el cráneo esté completamente adelgazado. Los vasos sanguíneos deben ser visibles a través del hueso adelgazado. Retire el tapón de hueso suavemente con pinzas finas de 45 °. Retire la duramadre con pinzas # 5. Paso crítico: Una vez que el tejido cerebral está expuesto, siempre mantener el tejido húmedo. Coloque un hisopo de algodón sumergido en solución salina estéril sobre la craneotomía. Esto también mantendrá la presión sobre el tejido. Para aliviar la presión en el tejido cerebral duAnillo de inserción de la sonda de prisma, crear un tramo de inserción antes de tiempo. Conecte un cuchillo de disección de filo recto al brazo portaelectrodos del aparato estereotáxico y colóquelo en el aparato estereotáxico en un ángulo tal que la cuchilla sea perpendicular a la curvatura del cráneo (ángulo de 10 ° en este caso) y en un Paralelo a la columna de inyección de virus. Cuidadosamente colocar el cuchillo por encima de la craneotomía a lo largo de su borde medial anterior en este caso y ~ 200 μm lateral al sitio de inyección del virus con el filo de corte hacia atrás ( Figura 1 ). Cero fuera del eje Z cuando la punta del cuchillo toca el pia y baje gradualmente (en incrementos de 10 μm / s) a una profundidad a la cual se inserta la sonda del prisma. A continuación, mueva el cuchillo 1 mm hacia atrás para crear un camino para el borde de ataque del prisma. Pausa y control de cualquier sangrado que pueda ocurrir mientras se realiza la incisión con un trozo de gelfoam empapado en solución salina pre-estéril. <li> Una vez que el cuchillo esté en esta posición, enjuague el sitio con solución salina estéril y espere hasta que desaparezca cualquier sangrado. A continuación, retraer lentamente la cuchilla utilizando el micromanipulador del brazo estereotáxico en incrementos de 10 μm / sy colocar un trozo de esponja de gelatina empapada en solución salina estéril sobre la incisión. Conecte el soporte del objetivo (con la sonda de prisma y el microscopio) al brazo manipulador estereotáxico con el mismo ángulo que el cuchillo en el paso anterior. Alinee el prisma de manera que el lado plano del prisma se encuentre sobre la incisión y paralelo a la columna de inyección de virus. Este paso podría requerir una corrección fina de la posición del brazo estereotáxica. Ajuste la alineación manteniéndose cerca del cráneo para obtener resultados más rápidos. Una vez que el prisma esté en el ángulo correcto, gradualmente baje en el cerebro en incrementos de 10 μm hasta un z final de 1,1 mm para esta sonda, comenzando desde la superficie del cerebro. El tejido cerebral se expandirá alrededor del prisma y cualquier presión que se cree está detrás de la visualizaciónEn el plano y no afectará el campo de visión. Conecte el microscopio a un ordenador con software de adquisición instalado a través de un puerto USB3 y visualice la fluorescencia de campo encendiendo el LED. Cubra cualquier tejido expuesto alrededor del prisma en la craneotomía en una capa protectora muy fina de adhesivo de elastómero usando una aguja de 25G. Después de que el adhesivo de elastómero se cure (usualmente en ~ 3-5 min) use una aguja de 25G para aplicar un poco de adhesivo de cianoacrilato para fijar el cristal de la lente de prisma al cráneo adyacente sobre la capa de adhesivo de elastómero, La craneotomía. Incluya los bordes del manguito de la sonda prismática para una mejor adherencia. No coloque ningún adhesivo sobre la superficie superior de la sonda de prisma implantada. Una vez que se haya curado el adhesivo de cianoacrilato, desenrosque el portaobjetos y retire cuidadosamente el microscopio. A continuación, retraer lentamente el brazo manipulador estereotáxico para dejar la sonda de prisma firmemente implantada. Aplique una capa de acrílico dental oCyanoacrylate alrededor del implante para cubrir toda la superficie expuesta del cráneo, hasta pero no tocando el tejido de músculo retraído circundante. Cubrir un área grande del cráneo con este casquillo craneal ayudará más adelante en el accesorio de la placa base. La piel alrededor del sitio del implante debe curarse por sí misma alrededor de la tapa craneal. Paso crítico: No deje que el adhesivo toque nada de la piel circundante o tejido muscular, y no engullir ninguna piel en la tapa craneal. Hacerlo irritará la piel, y puede resultar en raspadura excesiva y daño potencial al implante. Opcional: Si desea utilizar una configuración de cabeza fija despierta para conectar y desacoplar el microscopio a la placa base de un animal en sesiones de formación de imágenes experimentales en lugar de anestesiar o anidar brevemente al animal, implante un cabezal en la cápsula craneal que sea compatible con una cabeza despierta, Configuración fija de elección (no se demuestra en este protocolo). Mezclar el catalizador y la base de un silicioE una jeringa adhesiva y coloque una gota del elastómero en el interior del manguito de la sonda prismática para cubrir la parte superior de la lente de la sonda para evitar cualquier daño y el polvo de sedimentación. Quitar el animal del marco estereotáxico y permitir la recuperación de la anestesia en una cámara caliente. Administrar ketoprofeno (2,5 mg / kg) o carprofeno (2,5 mg / kg) por vía subcutánea y devolver el animal a una jaula casera limpia una vez que sea ambulatorio. Singly casa todos los sujetos para proteger el implante y repetir la dosis 24 h más tarde. 4. Accesorio de la placa base para la instalación del microscopio en miniatura Una semana a 10 días después de implantar la sonda de prisma, comprobar la expresión del virus en el tejido a través de la sonda de prisma implantada y fijar una placa de base en el cráneo si la preparación muestra actividad celular. El microscopio se acoplará en la placa base durante la imagen en vivo. Siga los pasos indicados en el procedimiento preoperatorio para preparar el animal para la fijación de la placa base. Retire la tapa adhesiva de silicona sobre la superficie de la parte superior de la lente de la sonda prismática implantada. Examine la superficie de la sonda de la lente y limpie los residuos cuidadosamente con papel para lentes y etanol al 70% para asegurar que la superficie de la imagen esté limpia. Conecte el microscopio a su caja DAQ y conéctelo a través del puerto USB3 al PC. Abra el software de adquisición en la computadora y conecte el microscopio a través del puerto USB3. Utilice el software de adquisición para comprobar la actividad neuronal y para medir y documentar la configuración del campo de visión para futuras grabaciones en este tema. Conecte una placa de base al microscopio y fije el tornillo de fijación de la placa base para sujetar la placa base en posición y asegure el microscopio en la pinza del microscopio en el brazo del micromanipulador estereotáxico por el cuerpo del microscopio. Conecte la pinza a una varilla de Newport, que se puede montar en el brazo del micromanipulador estereotáxico. Coloque el microscopio por encima de la lente de la sonda de prisma utilizando los sBrazo micromanipuador tereotáxico. Inspeccione visualmente la orientación observando la lente del prisma desde el lado y la parte posterior de la etapa animal. Los ejes ópticos del objetivo del microscopio y de la lente de la sonda de prisma deben estar alineados. Encienda el microscopio LED a través del software. Evaluar la calidad de la alineación del microscopio centrándose en la cara superior de la lente de sonda prismática implantada en el software de adquisición. Cuando estén correctamente alineados, los bordes de la cara superior de la lente de la sonda de prisma deben ser afilados. Ajuste la distancia física del microscopio por encima de la sonda de prisma implantada utilizando el brazo manipulador estereotáxico para obtener el plano focal deseado dentro del tejido. La distancia ópticamente optimizada entre el objetivo del microscopio y la lente GRIN implantada es de ~ 500 μm. Guarde una imagen de fluorescencia de referencia una vez que se capture el plano de imagen deseado. Punto crítico: A partir de este punto, no ajustar la posición del microscopio, ya que esto cambiará la locatiEn el plano de imagen en el tejido. NOTA: Aplique adhesivo en el siguiente paso para fijar permanentemente la posición de la placa base en relación con la tapa craneal. El adhesivo puede experimentar cierta contracción de volumen en el día siguiente o dos, lo que puede cambiar el plano focal en el tejido. Preemptivamente cuenta de esto mediante la medición de la cantidad de contracción de su mezcla adhesiva y la distancia ex vivo , a continuación, el respaldo de la posición final Z del microscopio + placa base en esa cantidad antes de avanzar a la etapa de aplicación de adhesivo. Utilice acrílico dental o cianoacrilato para fijar permanentemente la placa de base a la tapa de acrílico que cubre el cráneo del animal, puenteando el hueco con el acrílico o el adhesivo. La aplicación gradual del acrílico / cianoacrilato dental y el curado en múltiples etapas pueden minimizar el efecto de la contracción anteriormente mencionada sobre la posición final del plano de imagen del microscopio. Paso crítico: Tenga cuidado al aplicar los dientesAcrílico / cianoacrilato para evitar que cualquier material entre en contacto con la lente objetiva del microscopio, el tornillo de fijación o el cuerpo del microscopio, lo que impedirá el correcto funcionamiento de la instrumentación más adelante. Paso crítico: Mientras se aplica el adhesivo, no presione el microscopio. La presión sobre el microscopio o la placa base puede causar el movimiento del objetivo del microscopio con respecto a la lente de la sonda de prisma, lo que podría dar lugar a una desalineación o un cambio del plano focal en el tejido que requeriría un reajuste rápido. Verifique que el acrílico / cianoacrilato dental haya curado y endurecido tocando el acrílico con un par de fórceps o una punta de jeringa. Adquirir una imagen de fluorescencia de referencia final con el software de adquisición. Suelte el microscopio de la pinza y retraiga la pinza del microscopio. Si se utilizó cianoacrilato u otro adhesivo transparente, cubrirlo con esmalte de uñas negro o una capa de cemento dental negro paraMbient fuga de luz en la tapa de la cabeza, que puede contaminar futuras imágenes adquiridas durante los experimentos. En este punto, retire el microscopio si es necesario. Para separar el microscopio de la placa base, suelte el tornillo de ajuste de la placa base girando el tornillo de ajuste aproximadamente ½ vuelta en sentido antihorario. Pellizque el cuerpo del microscopio mientras sostiene la placa base y la tapa acrílica con la otra mano, y tire del microscopio hacia arriba. Vuelva a colocarlo en su recipiente de almacenamiento. Proteja la sonda de prisma implantada con una cubierta de placa base. Esto evitará que las partículas de polvo se asienten en la superficie de la lente, lo cual puede ser difícil de limpiar después de que la placa base haya sido instalada. Sujete la cubierta de la placa de base en la placa base y avance el tornillo de ajuste en un ½ vuelta aproximadamente en el sentido de las agujas del reloj o hasta que el tornillo de ajuste quede al ras con la cubierta de la placa base. No lo apriete demasiado. Retire el animal de la anestesia y el monitor en una cámara de recuperación caliente hasta ambulatorio. RegresoE animal a su jaula de origen. Aloje individualmente a todos los animales con bases implantadas para proteger el implante. 5. Imaging múltiples capas corticales en un ratón que se mueve libremente Prepare el aparato conductual ( por ejemplo , Phenotyper, Noldus) limpiándolo y desinfectándolo y limpiándolo con una solución de lejía al 10%. Conecte el microscopio a su caja DAQ, y conéctelo al ordenador y ejecute el software de adquisición. Compruebe el amplio espacio de almacenamiento de archivos en la computadora de adquisición y haga espacio para las películas de imágenes de calcio. Guarde directamente desde el software en el disco duro local, en lugar de escribir en un disco duro externo, para acomodar la alta velocidad de transferencia de datos entre el microscopio y la computadora y evitar la pérdida de datos durante las grabaciones. Anestesiar el animal con isoflurano (5% en oxígeno) en una cámara de inducción para fijar el microscopio. Alternativamente, suavemente scruff el animal o utilizar una configuración de cabeza fija despiertoCon un cabezal si se sabe que la anestesia interfiere con el paradigma conductual de elección. Retire la cubierta de la placa base girando el tornillo de la placa base en sentido contrario a las agujas del reloj y levantando la cubierta de la placa base. Asiente el microscopio en la base del animal. El microscopio debe encajar en su lugar con la ayuda de los imanes en la placa base. Avance el tornillo de fijación de la placa base hasta que se sienta una ligera resistencia. Paso crítico: No apriete demasiado el tornillo de fijación de la placa base para evitar daños en la carcasa del microscopio. Compruebe el plano de imagen en el tejido mediante la adquisición de una instantánea de fluorescencia en el software y, si es necesario, ajustar el plano focal en el tejido, aflojando el tornillo de la torreta del microscopio, girando la torreta de microscopio para ajustar el enfoque fino y volver a apretar la torreta Tornillo de fijación de la carcasa. Paso crítico: Nunca fuerce la torreta a girar sin primero aflojar el tornillo de ajuste, yNo apriete demasiado el tornillo de fijación de la torreta. Si se realiza un estudio longitudinal, volver a la posición de torreta física para capturar el mismo campo de visión. En el hardware, tenga en cuenta el número de vueltas de la torreta, o la posición física de la torreta, para cada animal con imágenes del mismo microscopio para un rápido retorno al mismo campo de visión. Libere al animal que transporta el microscopio a su jaula doméstica o cámara de conducta para que se aclimate y espere a que se le quite la anestesia, si corresponde. Paso crítico: Capacitar a los animales para que lleven el peso del microscopio usando un microscopio ficticio durante varias sesiones hasta asegurarse de que el uso del microscopio no interfiera con su comportamiento normal, antes de comenzar las sesiones experimentales. Manejo y entrenamiento regulares para la retención despierta prevenir el estrés innecesario a los animales. Seleccione los ajustes de adquisición que se utilizarán para recopilar datos. Esto incluye el fraMe para la captura de datos ( por ejemplo, 20 fps, ganancia de 1, y la potencia del LED de 50%). Compruebe el histograma de la imagen al seleccionar los ajustes para garantizar una buena SNR. NOTA: La apertura numérica para la recolección de fluorescencia es de 0,35 para la sonda de prisma de 1 mm en comparación con 0,5 para la sonda recta de 1 mm. Inicie el software de comportamiento y programarlo para activar el microscopio en el ciclo de grabación de imágenes deseado ( por ejemplo, 4X 5 min ON 2 min OFF). Conecte el puerto TTL de la caja de Noldus IO al puerto TRIG de la caja DAQ a través de un cable RJ45 a BNC. Coloque al animal en el campo de comportamiento si no está ya allí, e inicie el experimento. Después de adquirir los datos deseados, volver a anestesiar el animal con isoflurano (5% en oxígeno) en una cámara de inducción, o suavemente despierta-restringir el animal. Afloje el tornillo de fijación de la placa de base y separe el microscopio de la placa de base tirando suavemente del microscopio. Vuelva a colocar la cubierta de la placa base y apriete suavemente la placa baseEl tornillo de ajuste. Devuelva el animal a la jaula de casa hasta la próxima sesión de grabación. Utilice las imágenes de fluorescencia de referencia como guía para que las siguientes sesiones de formación de imágenes vuelvan al mismo campo de visión. 6. Evaluación de los datos de formación de imágenes de Ca 2+ a gran escala Para extraer la localización celular y la dinámica de Ca 2 + dentro del campo de visión a partir de datos, se pueden utilizar diferentes plataformas de análisis de datos. Mosaic, una plataforma de análisis de datos diseñada específicamente para procesar a gran escala Ca 2 + películas de imágenes se ha utilizado para este estudio aquí. Rectificar píxeles defectuosos e interpolar cualquier fotogramas individuales en las películas sin procesar en el paso de preprocesamiento. Bin las imágenes en el espacio desde el campo de visión de 1.440 x 1.080 píxeles a 720 x 540 píxeles para reducir la huella de datos. Para corregir los artefactos de movimiento en el cerebro con respecto al sensor de imagen del microscopio, registre las películas usando una imagen basada en ImageJAlgoritmo de registro (TurboReg). Para identificar las neuronas individuales, re-expresar las imágenes como cambios relativos en la fluorescencia ΔF / F 0 = FF 0 / F 0 donde F 0 es la media de la imagen obtenida mediante el promedio de toda la película. Identificar los filtros espaciales correspondientes a las células individuales utilizando un algoritmo establecido de clasificación de células. Aquí hemos utilizado el análisis de componente principal e individual 21 para identificar las neuronas individuales. NOTA: Se especificó un evento cuando la amplitud máxima de un evento en una traza era más de 8 desviaciones estándar de la línea de base de la traza en nuestro conjunto de datos y la ubicación de la celda y los datos de dinámica de Ca2 + se exportaron para análisis adicionales.