多层皮质Ca²⁺使用棱镜探针和小型荧光显微镜成像自由移动的小鼠

涉及动物受试者的程序已得到加利福尼亚州美国航空航天局艾姆斯研究中心的LifeSource生物医学服务机构动物保护和使用委员会（IACUC）的批准。 术前准备在热珠灭菌器中灭菌外科手术中使用的工具，并用70％乙醇擦拭手术区域。打开放置在立体定位台上的加热垫，并将其保持在37°C。 使用异氟醚麻醉动物（5％用于诱导，1-2％用于维持，0.6-0.8L / min O 2 ）。检查没有脚趾反射以评估麻醉深度。 将动物安装在装有耳朵和牙齿条的立体定位框架中。 将眼科软膏涂在动物的眼睛上，用一张深色纸盖住它们，以防止它们干燥和强烈的手术灯。 用酮洛芬皮下注射动物（2.5mg / kg）或卡洛芬（2.5mg / kg） 病毒注射手术修剪和剃刮眼睛和耳朵之间的头皮，并用3个70％乙醇和betadine的替代拭子消毒皮肤。 通过在头皮中切开头部，从眼睛之间开始并用无菌外科手术刀片延伸1.5厘米的腰带，露出头骨。打开皮肤暴露头骨，并使用棉签和手术刀去除所需注射部位周围的骨膜。用无菌PBS冲洗颅骨。用棉签清洁头发并擦亮。 调整头骨，并用标记，标记病毒注射的立体定位坐标。在高速微型钻（使用约7,000-10,000转/分钟）上使用0.5毫米毛刺，在颅骨上创造一个小洞。在钻孔时施加轻微的压力，并间歇地清洁骨灰，并用无菌PBS润湿该区域，以防止脑组织过热，直到脑表面恢复疼痛难忍。保持脑部潮湿，钻孔。 在微量注射器中使用26 G针头接种病毒（ 如 AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40），然后用35 G针进行注射。将装有病毒的微量注射器连接到立体定位装置的操纵臂上。 将注射器靠近注射部位孔并调整针的角度，使其与脑表面成90度角。降低针头直到触碰皮肤并穿透硬脑膜。开始以10μm/ s的增量降低针，直至达到所需的深度（z）。使用立体定位臂固定针位置。 设置微量注射泵以25 nL / min注入250 nL病毒。 临界步骤：由于待注射的病毒体积取决于滴度和稀释度，事先进行稀释实验，以确定成像细胞的最佳体积和浓度标准在实验中。 如果看到某些病毒从注射部位渗出，请暂停注射，等待脑组织吸收病毒滴。注射总体积之后等待5-7分钟，然后取出针头。染色体如绿色绿也可以添加到病毒溶液中，以帮助控制在病毒被渗出脑部表面的情况下的注射速率。 为了在皮质中标记多层，必要时使用多次注射。首先从最腹部的部位开始，注射后等待5-7分钟，然后将针头拉至下一个最背部注射点（ 例如注射-1.0毫米AP，1.5毫米±ML和400和600微米DV）。在最后一次注射后10分钟，然后拔出针头并将其从立体定位装置中取出。 从双筒注射器中混合少量体内生物相容的透明弹性体粘合剂（例如Kwik-Sil），并用它覆盖颅骨中的孔。将氰基丙烯酸酯粘合剂涂在弹性体粘合剂层的顶部并使其固化。 缝合头皮，并允许动物在温暖的恢复笼中从麻醉中恢复，直到它走动。皮下注射酮洛芬（2.5 mg / kg）或卡洛芬（2.5 mg / kg），然后将动物送回家中。单独住院手术对象保护手术部位，并在24小时后重复使用。 取出微量注射器后，用蒸馏水冲洗26 G和35 G针头7-10次，待储存前进行清洗。 棱镜探头植入手术病毒注射1-2周后，准备进行棱镜探针植入手术。在70％乙醇中消毒棱镜探头，并用透镜纸清洁。将棱镜探头插入镜头固定器工具，然后用螺丝刀拧紧六角螺丝。将显微镜置于基座（的位置）磁铁将其固定到位）。 根据术前准备部分所述准备动物。 修剪和剃刮眼睛和耳朵之间的动物头部，并用70％乙醇和betadine的替代拭子消毒皮肤。 通过用一把无菌剪刀切开皮肤暴露头骨，并移除皮瓣和下面的骨膜。用棉签擦干头骨。确保充分去除周围的肌肉组织，以创建一个干净，干燥，宽的骨基础，准备以下步骤。 植入颅骨螺钉在对侧半球，使植入物稳定和安全。如果选择植入用于清醒头部固定的头条来准备动物以进行第5节中的实验成像会话，这些也可能是有用的。 对头骨进行调整，并用标记标记AP和ML坐标以进行镜头插入。在微型钻机上使用0.5毫米毛刺打开圆形开颅手术，确保在这种情况下，开颅直径大于棱镜直径， 即 1.0mm。在间歇性地暂停冲洗，用无菌PBS冲洗颅骨，并用棉签将其吸出。清除所产生的骨灰尘。 临界步骤：放置开颅手术，使得当棱镜插入皮层时，其平坦的边缘（成像表面）面向病毒注射部位，半径在150-200μm之内。 在头骨完全变薄之前就停止钻孔。血管应通过变薄的骨骼可见。用精细的45°镊子轻轻取出骨头。 用＃5镊子去除硬脑膜。 关键步骤：一旦脑组织暴露，始终保持组织湿润。放置一个棉签浸在无菌盐水上开颅手术。这也将保持对组织的压力。 减轻脑组织压力环形插入棱镜探头，提前插入。将直边切割刀连接到立体定位装置的电极支架臂上，并将其安装在立体定位装置上，角度使得刀片垂直于颅骨的曲率（在这种情况下为10°角），并且在平行于病毒注射柱的平面。 在这种情况下，小心地将刀沿其前内侧位于开颅上方，并且病毒注射部位的侧面约为200μm，刀刃朝后（ 图1 ）。当刀尖接触皮肤并逐渐降低（以10μm/ s为增量）将Z轴切除到棱镜探针插入的深度。然后将刀移动到后方1 mm处，以创建棱镜前缘的路径。暂停和控制在使用预先无菌生理盐水浸泡的美沙佛明的切片进行切口时可能发生的任何出血。 <li>一旦刀在这个位置，用无菌盐水冲洗现场，等到任何出血消退。然后用立体定位臂显微操纵器以10微米/秒的速度慢慢收缩刀，并将一块置于无菌盐水中的海藻海绵浸在切口上。 将镜头支架（带棱镜探头和显微镜）以与上一步相同的角度与立体定位机械手臂相连。对准棱镜，使得棱镜的平坦侧面在切口上方并且平行于病毒注射柱。该步骤可能需要对立体定位臂位置进行一些精细校正。通过保持靠近头骨的方式调整对准以获得更快的效果。 一旦棱镜处于正确的角度，从脑部开始，以10μm的增量将其逐渐降低至大脑中1.1 mm的最终z。脑组织会在棱镜周围扩张，任何产生的压力都在视觉上在飞机上，不会影响视野。将显微镜插入计算机，并通过USB3端口安装采集软件，并通过打开LED显示现场荧光。 使用25G针将非常薄的弹性体粘合剂保护层覆盖开颅手术周围棱镜周围的任何暴露组织。 弹性体粘合剂固化后（通常为〜3-5分钟），使用25G针头涂抹一些氰基丙烯酸酯粘合剂，将棱镜透镜的玻璃贴在弹性体粘合剂层上的相邻颅骨上，以防透镜移动开颅手术包括棱镜探针袖口的边缘以获得更好的粘附力。不要在植入的棱镜探头的顶面上看到任何粘合剂。一旦氰基丙烯酸酯粘合剂固化，拧下镜头支架，并小心地取出显微镜。然后缓慢缩回立体定位机械手臂，使棱镜探针牢固植入。 涂一层牙科丙烯酸或氰基丙烯酸酯粘合剂在植入物周围覆盖所有暴露的颅骨表面，直到但不接触周围的收缩的肌肉组织。用这种颅盖覆盖大面积的头骨将有助于基板附件。植入物周围的皮肤应自行修复颅盖周围。 关键步骤：不要让粘合剂接触任何周围的皮肤或肌肉组织，并且不要吞没颅盖中的任何皮肤。这样做会刺激皮肤，并可能导致植入物过度刮伤和潜在的损伤。 可选：如果希望使用清醒的头枕固定装置在实验成像过程中将显微镜连接到动物的基板上，而不是简单地麻醉或擦伤动物，则将头盖植入头盖，选择的固定设置（在本协议中未示出）。 从硅中混合催化剂和碱e粘合剂注射器，并将一滴弹性体放入棱镜探针袖口内以覆盖探头镜头顶部，以防止任何损坏和灰尘沉降。 从立体定位框架中取出动物，并允许在温室中从麻醉中恢复。皮下注射酮洛芬（2.5mg / kg）或卡洛芬（2.5mg / kg），一旦移动，将动物返回到干净的家中。单独安置所有受试者保护植入物并在24小时后重复使用。 4.微型显微镜安装基板附件在植入棱镜探针后一周至10天，通过植入式棱镜探头检查组织中的病毒表达，如果制剂显示细胞活性，则将底板附着在颅骨上。在实时成像期间，显微镜将停靠在底板上。 按照术前手术中列出的准备动物基板附件的步骤进行。 在植入的棱镜探针镜头顶部的表面上取下硅胶胶盖。检查镜头探头表面，并用镜头纸和70％乙醇轻轻清除任何碎屑，以确保成像表面清洁。 将显微镜插入其DAQ盒，并将其通过USB3端口连接到PC。 打开计算机上的采集软件，并通过USB3端口连接显微镜。使用采集软件检查神经活动，以及测量和记录本主题中将来录制的视野设置。 将底板安装在显微镜上，并固定底板固定螺丝，将底板固定就位，并将显微镜固定在显微镜主体上的立体定位显微操纵臂上的显微镜夹具上。将夹具连接到可以安装在立体定位显微操纵臂上的Newport杆。 使用s将显微镜放置在棱镜探头镜头的上方立体定位微型制导臂。通过从动物阶段的侧面和背面观察棱镜，目视检查方向。显微镜物镜和棱镜探头镜头的光轴必须对齐。 通过软件打开显微镜LED。通过在采集软件中聚焦在植入式棱镜探针镜头的顶面来评估显微镜对准的质量。当正确对准时，棱镜探头镜头顶面的边缘应该是锋利的。 使用立体定位机械手臂调整显微镜在植入式棱镜探头上方的物理距离，以获得组织内所需的焦平面。显微镜物镜和植入的GRIN透镜之间的光学优化距离为〜500μm。 一旦捕获所需的成像平面，保存参考荧光图像。 关键点：从这一点上，不要调整显微镜的位置，因为这会改变位置在组织中的成像平面上。 注意：在下一步中涂抹粘合剂以永久固定基板相对于颅盖的位置。粘合剂在第二天或两天会经历一些体积收缩，这可能改变组织中的焦平面。通过测量粘合剂混合物的收缩量和离体距离，先预先说明这一点，然后在进行粘合剂涂布步骤之前将显微镜+底板的最终Z位置支撑该量。 使用牙科丙烯酸或氰基丙烯酸酯将基板永久地附着在覆盖动物头骨的丙烯酸盖上，与丙烯酸或粘合剂桥接间隙。逐步应用牙科丙烯酸/氰基丙烯酸酯和多级固化可以最小化上述收缩对显微镜图像平面最终位置的影响。 关键步骤：应用牙科时要小心丙烯酸/氰基丙烯酸酯，以防止任何材料接触显微镜的物镜，定位螺丝或显微镜主体，这将阻碍仪器的适当操作。 关键步骤：使用粘合剂时，请勿推动显微镜。显微镜或底板上的压力可能导致显微镜物镜相对于棱镜探针镜头的移动，这可能导致组织中的未对准或焦平面的变化，这将需要及时的重新调整。 验证牙科丙烯酸/氰基丙烯酸酯通过用一对镊子或注射器尖端敲击丙烯酸酯已经固化和硬化。使用采集软件获取最终参考荧光图像。 从夹具上取下显微镜并从显微镜上收回夹具。如果使用氰基丙烯酸酯或其他透明粘合剂，用黑色指甲油或一层黑色牙科水泥覆盖以防止mbient光泄漏到头盖，这可能会污染在实验期间获得的未来图像。 此时，如果需要，请取出显微镜。为了将显微镜与基板分离，请通过逆时针方向旋转固定螺丝约1/2圈来松开底板固定螺丝。夹住显微镜主体，另一只手支撑底板和丙烯酸盖，然后将显微镜向上拉。将其更换在其存储容器中。 用底板盖保护植入的棱镜探头。这将防止任何灰尘颗粒沉淀在透镜表面上，这在安装底板后可能会很麻烦。 将基板盖板安装在底板上，顺时针方向将定位螺丝推入约1/2圈，或直到固定螺丝与底板盖齐平。不要过度紧张从麻醉中取出动物，并在温暖的恢复室中进行监测，直到不动。回来了e动物到它的家笼。用植入的基板单独安置所有动物，以保护植入物。 5.在自由移动的鼠标中成像多个皮质层通过清洁和消毒，并用10％漂白溶液擦拭，准备行为装置（ 如 Phenotyper，Noldus）。 将显微镜插入其DAQ盒子，并将其连接到计算机并启动采集软件。 检查采集计算机上是否有足够的文件存储空间，为钙成像电影腾出空间。直接从软件保存到本地硬盘，而不是写入外部硬盘驱动器，以适应显微镜和计算机之间的高数据传输速率，并防止录制过程中的数据丢失。 在感应室中用异氟烷麻醉麻醉（5％氧气）以附着显微镜。或者，轻轻擦伤动物或使用清醒的头部固定设置如果已知麻醉剂干扰选择的行为范式，则使用头条。 逆时针转动底座固定螺丝，取出底板盖，并将底板盖取出。 将显微镜放在动物的底板上。借助于底板上的磁铁，显微镜应该卡入到位。推进底板固定螺丝，直到感觉到轻微的阻力。 关键步骤：不要过度拧紧底板固定螺丝，以免损坏显微镜外壳。 通过在软件中获取荧光快照检查组织中的成像平面，如果需要，通过松开显微镜转塔固定螺丝来调整组织中的焦平面，旋转显微镜转台调整精细对焦，然后重新拧紧转盘外壳固定螺丝。 关键步骤：切勿在没有松开固定螺丝的情况下强制转动转盘，而且不要拧紧转塔固定螺丝。 如果进行纵向研究，返回到物理炮塔位置以捕获相同的视野。在硬件中，请注意使用相同显微镜拍摄的每只动物的炮塔转弯数量或炮塔的物理位置，以便快速恢复到相同的视野。 将携带显微镜的动物释放到其家中的笼子或行为室适应适应，并等待穿戴麻醉（如果适用）。 关键步骤：使用虚拟显微镜训练动物携带显微镜的重量几次，直到确保戴上显微镜不会干扰其正常行为，才能开始实验。定期处理和训练清醒约束将防止动物过度的压力。 选择要用于收集数据的采集设置。这包括我捕获数据的速率（ 例如 20 fps，增益为1，LED功率为50％）。选择设置时检查图像直方图以确保良好的信噪比。 注意：1 mm棱镜探头的荧光采集数值孔径为0.35，而直径为1mm的探针则为0.5。 启动行为软件并对其进行编程，以在所需的成像记录周期（ 例如 ，4X 5分钟ON 2分钟OFF）触发显微镜。将Noldus IO盒上的TTL端口通过RJ45至BNC电缆连接到DAQ盒上的TRIG端口。 如果不在那里，将动物放在行为领域，并开始实验。 获取所需数据后，在感应室中用异氟烷（5％氧气）重新麻醉动物，或轻轻地清醒动物。 松开底板固定螺丝，轻轻拉起显微镜，将显微镜从底板上取下。更换底板盖板，轻轻拉紧底板te固定螺丝。 将动物返回家庭笼子直到下一个记录会话。使用参考荧光图像作为后续成像会话的指南，以返回到相同的视野。 6.评估大规模Ca 2+成像数据为了从数据中提取视场内的细胞位置和Ca 2+动力学，可以使用不同的数据分析平台。马赛克是一种专门用于处理大型Ca 2+成像电影的数据分析平台，用于本研究。 纠正缺陷像素，并在预处理步骤中插入原始动画中的任何单个丢弃帧。将空间中的图像从完整的1,440 x 1,080像素视野中分解为720 x 540像素，以减少数据占用。 为了校正相对于显微镜图像传感器的大脑中的运动伪像，使用严格的基于ImageJ的图像记录电影触发算法（TurboReg）。 为了识别单个神经元，将图像重新表达为荧光的相对变化ΔF/ F 0 = FF 0 / F 0 ，其中F 0是通过对整个电影进行平均而获得的平均图像。 使用建立的细胞分选算法识别与各个细胞相对应的空间滤波器。在这里，我们使用主成分和单个成分分析21来识别个体神经元。 注意：当轨迹中的事件的峰值幅度与我们的数据集中的迹线基线超过8个标准偏差时，指定了一个事件，并且输出了细胞位置和Ca 2+动力学数据进行进一步分析。