Многослойный кортикальный Ca²⁺ Визуализация в свободно перемещающихся мышах с помощью призматических зондов и миниатюрной флуоресцентной микроскопии

Процедуры, связанные с животными, были одобрены Институтом по уходу и использованию животных (IACUC) в LifeSource Biomedical Services, Исследовательском центре NASA Эймс, Калифорния. 1. Предварительная подготовка Стерилизуйте инструменты, которые будут использоваться в хирургических процедурах в стерилизаторе с горячим бусильником, и протрите хирургическую зону 70% этанолом. Включите нагревательную подушку, расположенную поверх стереотаксической ступени, и поддерживайте ее при 37 ° C. Анестезируйте животное, используя изофлуран (5% для индукции и 1-2% для поддержания, 0,6-0,8 л / мин O 2 ). Проверьте отсутствие рефлекса пальца ноги, чтобы оценить глубину анестезии. Установите животное в стереотаксическую раму, снабженную ушами и зубьями. Нанесите глазную мазь на глаза животного и накройте их куском темной бумаги, чтобы защитить их от сушки и интенсивных хирургических огней. Подкожно вводить животное кетопрофеном (2,5Мг / кг) или карпрофен (2,5 мг / кг) 2. Хирургия инъекций вирусов Обрежьте и побрите скальп между глазами и ушами и продезинфицируйте кожу тремя альтернативными тампонами из 70% этанола и бетадина. Выложите череп, сделав надрез в скальпе, начиная между глаз и расширяя 1,5 см рострокаудала стерильным хирургическим лезвием. Откройте кожу, чтобы обнажить череп, и удалите надкостницу вокруг желаемого места инъекции с помощью ватных тампонов и скальпеля. Прополощите череп стерильным PBS. Очистите и отполируйте череп ватными тампонами. Выровняйте череп и отметьте маркеры стереотаксическими координатами для инъекций вируса. Используя заусенцы 0,5 мм на высокоскоростном микрорубке (установленном около 7000-10 000 об / мин), создайте небольшое отверстие в черепе. Нанесите небольшое давление во время сверления и периодически очищайте костную пыль и смачивайте область стерильным PBS, чтобы предотвратить перегрев ткани головного мозга, пока поверхность мозга не будет повторноболело. Держите мозг влажным, где отверстие просверлено. Используйте иглу 26 G для сбора вируса ( например, AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) в микрошприце, а затем замените его иглой 35 G для инъекций. Прикрепите микроширин, загруженный вирусом к манипулятору рычага стереотаксического аппарата. Принесите шприц близко к отверстию для места инъекции и отрегулируйте угол иглы, чтобы она попала под углом 90 ° к поверхности мозга. Опустите иглу, пока она не коснется pia mater и пронзите через твердую поверхность. Начинайте опускать иглу с шагом 10 мкм / с до достижения желаемой глубины (z). Закрепите положение иглы там, используя стереотаксический рычаг. Установите микросиринговый насос для инъекции 250 нл вируса при 25 нЛ / мин. Критический шаг: поскольку объем вируса, который нужно впрыскивать, зависит от титра и разбавления, эксперименты по разбавлению заблаговременно, чтобы установить оптимальные критерии объема и концентрации для изображенийВ эксперименте. Если какой-либо вирус виден из места инъекции, приостановите инъекцию и подождите, пока мозговая ткань не поглотит вирусную каплю. Подождите 5-7 минут после того, как общий объем был введен, прежде чем втягивать иглу. Красители, такие как быстрый зеленый, также могут быть добавлены к раствору вируса, чтобы помочь контролировать скорость инъекции в том случае, если вирус будет выходить из поверхности мозга. Для маркировки нескольких слоев в коре используйте при необходимости несколько инъекций. Сначала начинайте на вентральном участке, ожидая 5-7 минут после инъекции, и подтягивая иглу к следующей самой дорзальной точке для инъекций ( например, вводите на уровне -1,0 мм AP, 1,5 мм ± ML и 400 и 600 мкм DV). Подождите 10 минут после окончательной инъекции, прежде чем вытаскивать иглу и удалять ее из стереотаксической установки. Смешайте небольшое количество биосовместимого прозрачного эластомерного клея in vivo из шприца с двойным стволом (Например, Kwik-Sil) и покрыть отверстие в черепе. Нанесите цианоакрилатный адгезив поверх слоя эластомерного клея и дайте ему вылечить. Шовный скальп и позвольте животному оправиться от анестезии в теплой клетке для восстановления, пока она не станет амбулаторной. Администрирование кетопрофена (2,5 мг / кг) или carprofen (2,5 мг / кг) подкожно до возвращения животного в его домашнюю клетку. Одиночные предметы после операции для защиты места операции и повторная доза через 24 часа. После извлечения микросвинка промыть игольчатые иглы 26 G и 35 G в 7-10 раз дистиллированной водой для очистки перед хранением. 3. Хирургия имплантата имплантата призма 1-2 недели после инъекции вируса, подготовьтесь к операции имплантата с призматическим зондом. Дезинфицируйте зонд призмы в 70% этаноле и очистите его бумагой для линз. Вставьте зонд призмы в инструмент держателя объектива и затяните шестигранный винт с помощью отвертки. Установите микроскоп в держатель основания (Магниты будут удерживать его на месте). Подготовьте животное, как описано в разделе Pre-operative Preparation. Обрежьте и побрите голову животного между глазами и ушами и продезинфицируйте кожу альтернативными тампонами из 70% этанола и бетадина. Выставляйте череп, вызывая кожу с помощью пары стерильных ножниц и удаляйте лоскут кожи и лежащую под надкостницу. Высушите и полируйте череп ватными тампонами. Обеспечьте адекватное удаление окружающей мышечной ткани, чтобы создать чистый, сухой, широкий костный фундамент для подготовки к следующим этапам. Внесите имплантаты из черепа в контрлатеральное полушарие, чтобы сделать имплантат стабильным и безопасным. Они также могут быть полезны, если вы захотите имплантировать подставку для фиксации бодрствования головы, чтобы подготовить животное к экспериментальным сеансам визуализации в разделе 5. Выровняйте череп и отметьте маркеры AP и ML для установки объектива. Используя 0,5 мм заусенцев на микротрещине, открывайте круглую краниотомию, обеспечиваяДиаметр краниотомии в этом случае больше, чем диаметр призмы, т.е. 1,0 мм. Мягко будьте осторожны, делая паузу, чтобы очистить череп стерильным PBS и всасывать его ватными тампонами. Удалите образующуюся костную пыль. Критический шаг: поместите краниотомию таким образом, чтобы, когда призма была вставлена ​​в кору, ее плоский край (поверхность изображения) обращен к месту инъекции вируса и находится в радиусе 150-200 мкм. Прекратите сверление прямо перед тем, как череп полностью разжится. Кровеносные сосуды должны быть видны через разреженную кость. Извлеките костяной штекер осторожно с помощью мелких пинцетов на 45 °. Удалите дуру с помощью щипцов № 5. Критический шаг: как только ткань мозга обнажается, всегда держите ткань влажной. Поместите ватный тампон, погруженный в стерильный физиологический раствор, по краниотомии. Это также будет поддерживать давление на ткань. Чтобы облегчить давление в ткани головного мозга duКольцевая вставка зонда призмы, создайте дорожку ввода раньше времени. Прикрепите нож с прямым обрезанием к кронштейну держателя электрода стереотаксического аппарата и установите его на стереотаксическом аппарате под углом, так что лезвие ножа перпендикулярно кривизне черепа (угол 10 ° в этом случае) и в Плоскостью, параллельной колонке впрыска вируса. Осторожно расположите нож над краниотомией вдоль его переднего медиального края в этом случае и ~ 200 мкм в поперечном направлении к месту инъекции вируса с режущей кромкой, обращенной назад ( рис. 1 ). Извлеките ось Z, когда кончик ножа касается пиа и постепенно опустите его (с шагом 10 мкм / с) на глубину, на которой будет вставлен призменный зонд. Затем переместите нож на 1 мм назад, чтобы создать путь для передней кромки призмы. Пауза и контроль для любого кровотечения, которое может произойти при выполнении разреза с предварительно стерильным физиологическим раствором, пропитанным кусочком геллоама. <li> Как только нож находится в этом положении, промойте участок стерильным физиологическим раствором и подождите, пока не исчезнет кровотечение. Затем медленно втягивайте нож, используя стереотаксический микроманипулятор руки с шагом 10 мкм / с, и поместите кусок губчатой ​​губки, пропитанной стерильным физиологическим раствором над разрезом. Прикрепите держатель объектива (с призменным зондом и микроскопом) к рычагу стереотаксического манипулятора под тем же углом, что и нож на предыдущем шаге. Выровняйте призму так, чтобы плоская сторона призмы была над разрезом и параллельна колонке с инъекцией вируса. Этот шаг может потребовать некоторой тонкой коррекции положения стереотаксического рычага. Отрегулируйте выравнивание, оставаясь рядом с черепом для получения более быстрых результатов. После того, как призма находится под правильным углом, постепенно опустите ее в мозг с шагом 10 мкм до конечного z 1,1 мм для этого зонда, начиная с поверхности мозга. Ткань мозга будет расширяться вокруг призмы, и любое давление, которое создается, находится за визуализациейНа плоскости и не повлияет на поле зрения. Подключите микроскоп к компьютеру с программным обеспечением для сбора данных, установленным через порт USB3, и визуализируйте флуоресценцию поля, включив светодиод. Оберните любую открытую ткань вокруг призмы в краниотомию в очень тонком защитном слое эластомерного клея, используя иглу 25G. После отверждения эластомерного клея (обычно в ~ 3-5 мин) используйте иглу 25G для нанесения какого-либо цианоакрилатного адгезива, чтобы прикрепить стекло призменной линзы к прилегающему черепу над слоем эластомерного клея, чтобы предотвратить перемещение объектива внутри Краниотомия. Включите края манжеты зонда призмы для лучшей адгезии. Не используйте клей на верхней поверхности имплантированного призмы. После отверждения клея цианоакрилата отвинтите держатель объектива и осторожно удалите микроскоп. Затем медленно втягивайте рычаг стереотаксического манипулятора, чтобы надежно имплантировали зонд. Нанесите слой зубного акрила илиЦианоакрилатного клея вокруг имплантата, чтобы покрыть всю открытую поверхность черепа, до, но не касаясь окружающей убранной мышечной ткани. Покрытие большой площади черепа с этой черепной крышкой позже поможет в прикреплении к основанию. Кожа вокруг места имплантата должна исцелять самостоятельно вокруг черепной крышки. Критический шаг: не допускайте прилипания клея к окружающей среде или к мышечной ткани и не замазывайте кожу краниальной крышкой. Это приведет к раздражению кожи и может привести к чрезмерному царапинам и потенциальному повреждению имплантата. Необязательно: если вы хотите использовать пробужденную настройку с фиксированной головой для прикрепления и отсоединения микроскопа к базовой плите животного в экспериментальных сеансах визуализации, а не кратковременного обезболивания или скручивания животного, имплантируйте головной убор в черепном колпачке, который совместим со спиной, Фиксированная настройка выбора (не показана в этом протоколе). Смешайте катализатор и основание из кремнияE клейкого шприца и поместите каплю эластомера внутри манжеты призматического зонда, чтобы покрыть верхнюю часть зонда, чтобы предотвратить повреждение и пыль от осаждения. Удалите животное из стереотаксического каркаса и позвольте восстановить при анестезии в теплой камере. Администрируйте кетопрофен (2,5 мг / кг) или карпрофен (2,5 мг / кг) подкожно и возвращайте животное в чистую домашнюю клетку, когда он находится в амбулаторном состоянии. Соберите все предметы для защиты имплантата и повторите дозу через 24 часа. 4. Установка базовой плиты для установки миниатюрного микроскопа Через неделю или 10 дней после имплантации зонда призмы проверяйте экспрессию вируса в ткани через имплантированный зонд и прикрепите опорную плиту на черепе, если препарат показывает активность клеток. Микроскоп будет закрепляться на базовой плите во время живого изображения. Выполните шаги, описанные в предоперационной процедуре подготовки животного к прикреплению к основанию, Снимите силиконовый клейкий колпачок поверх поверхности имплантированной линзы зонда зонда. Осмотрите поверхность зонда линзы и аккуратно очистите все обломки бумагой для линз и 70% этанолом, чтобы поверхность изображения была чистой. Подключите микроскоп к DAQ-коробке и подключите его через порт USB3 к ПК. Откройте программное обеспечение для сбора данных на компьютере и подключите микроскоп через порт USB3. Используйте программное обеспечение для регистрации для проверки нейронной активности, а также для измерения и документирования настроек области просмотра для будущих записей в этом предмете. Прикрепите опорную плиту к микроскопу и закрепите установочный винт базовой пластины, чтобы удерживать опорную плиту в нужном положении, и закрепите микроскоп в захвате микроскопа на кронштейне стереотаксического микроманипулятора корпусом микроскопа. Прикрепите захват к стержню Newport, который может быть установлен на стереотаксическом кронштейне микроманипулятора. Расположите микроскоп над линзой призмы зонда, используя sТиротаксический микроманипулятор. Визуально осмотрите ориентацию, просмотрев призменный объектив со стороны и сзади животного. Оптические оси объектива объектива микроскопа и призмы должны быть выровнены. Включите светодиод микроскопа через программное обеспечение. Оцените качество выравнивания микроскопа, сосредоточив внимание на верхней поверхности имплантированной зондовой линзы призмы в программном обеспечении для сбора данных. При правильной выровненности края лицевой поверхности линзы призмы должны быть острыми. Отрегулируйте физическое расстояние микроскопа над имплантированным призменным зондом, используя рычаг стереотаксического манипулятора, чтобы получить желаемую фокальную плоскость внутри ткани. Оптически оптимизированное расстояние между объективом микроскопа и имплантированной линзой GRIN составляет ~ 500 мкм. Сохраните опорное изображение флуоресценции после захвата желаемой плоскости изображения. Критическая точка: с этого момента не настраивайте положение микроскопа, так как это изменит положениеНа плоскости изображения в ткани. ПРИМЕЧАНИЕ. Приложите клей на следующем шаге, чтобы надолго зафиксировать положение опорной плиты относительно черепной крышки. Клей может испытывать некоторую усадку объема на следующий день или два, что может изменить фокальную плоскость в ткани. Упреждайте это, измеряя количество усадки для вашей адгезивной смеси и расстояния ex vivo , а затем поддерживая конечное положение Z микроскопа + опорную плиту на эту величину до перехода на этап нанесения клея. Используйте зубной акрил или цианоакрилат для постоянного прикрепления опорной плиты к акриловому колпачку, покрывающему череп животного, перекрывая зазор акрилом или клеем. Применяя зубной акрил / цианоакрилат постепенно и отверждая на нескольких этапах, можно свести к минимуму эффект вышеупомянутой усадки в конечном положении плоскости изображения микроскопа. Критический шаг: соблюдайте осторожность при применении зубногоАкриловый / цианоакрилат, чтобы предотвратить контакт любого материала с объективом микроскопа, установочным винтом или корпусом микроскопа, что в дальнейшем предотвратит правильную работу прибора. Критический шаг: при нанесении клея не нажимайте на микроскоп. Давление на микроскоп или опорную плиту может привести к перемещению объектива микроскопа относительно объектива зонда призмы, что может привести к смещению или изменению фокальной плоскости в ткани, что потребует быстрой корректировки. Убедитесь, что зубной акрил / цианоакрилат отвердело и затвердело, постукивая акрилом парой пинцета или наконечника шприца. Получите окончательное опорное изображение флуоресценции с помощью программного обеспечения для сбора данных. Выньте микроскоп из захвата и втяните захват из микроскопа. Если использовали цианакрилат или другой прозрачный клей, накройте его черным лаком для ногтей или слоем черного зубного цемента, чтобы предотвратитьMbient light leakage в головную крышку, которая может загрязнять будущие изображения, полученные во время экспериментов. В этот момент удалите микроскоп, если необходимо. Для отделения микроскопа от опорной плиты отпустите установочный винт базовой пластины, повернув установочный винт приблизительно на ½ оборота против часовой стрелки. Зажмите корпус микроскопа, поддерживая опорную плиту и акриловый колпачок другой рукой, и вытащите микроскоп прямо вверх. Замените его в контейнере для хранения. Защитите имплантированный призменный зонд с крышкой опорной плиты. Это предотвратит осаждение пылевых частиц на поверхность объектива, что может быть сложно очистить после установки опорной плиты. Прикрепите крышку опорной плиты на опорной плите и выдвиньте установочный винт приблизительно на 1/2 оборота по часовой стрелке или до тех пор, пока установочный винт не окажется на одном уровне с крышкой базовой плиты. Не перетягивайте. Удалите животное из анестезии и наблюдайте в теплой камере восстановления до амбулаторного лечения. ВозвращениеЕ животное в его домашнюю клетку. Одиночно размещайте всех животных с имплантированными базовыми пластинами для защиты имплантата. 5. Отображение нескольких корковых слоев в свободно движущейся мышке Подготовьте поведенческий аппарат ( например, Phenotyper, Noldus), очистив и дезинфицируя его и вытирая 10% раствором отбеливателя. Подключите микроскоп к своему ящику DAQ и подключите его к компьютеру и запустите программное обеспечение для сбора данных. Проверьте наличие достаточного пространства для хранения файлов на компьютере сбора данных и освободите место для фильмов с изображениями с кальцием. Сохраняйте непосредственно из программного обеспечения на локальный жесткий диск, а не записывайте на внешний жесткий диск, чтобы обеспечить высокую скорость передачи данных между микроскопом и компьютером и предотвратить потерю данных во время записи. Анестезируйте животное изофлураном (5% в кислороде) в индукционной камере для прикрепления микроскопа. В качестве альтернативы, аккуратно скрутите животное или используйте пробужденную настройку с фиксированной головойС головкой, если анестезия, как известно, мешает поведенческой парадигме выбора. Снимите крышку опорной плиты, повернув установочный винт опорной плиты против часовой стрелки и снимите крышку опорной плиты. Поместите микроскоп в опорную плиту на животное. Микроскоп должен защелкнуться на месте с помощью магнитов на опорной плите. Продвиньте винт установочной пластины до тех пор, пока не почувствуете слабое сопротивление. Критический шаг: не затягивайте болт установочной пластины, чтобы предотвратить повреждение корпуса микроскопа. Проверьте плоскость изображения в ткани, получив флуоресцентный снимок в программном обеспечении, и при необходимости отрегулируйте фокальную плоскость в ткани, ослабив установочный винт башни микроскопа, повернув башню микроскопа, чтобы отрегулировать тонкую фокусировку, затем снова затяните турель Болт крепления корпуса. Критический шаг: никогда не заставляйте турель поворачиваться без предварительного ослабления установочного винта иНе затягивайте болт крепления револьверной головки. Если вы проводите продольное исследование, вернитесь в физическую позицию башни, чтобы зафиксировать одно и то же поле зрения. В аппаратных средствах обратите внимание на количество поворотов турели или физическое положение башни для каждого животного, изображенного с помощью того же микроскопа, для быстрого возвращения в ту же область обзора. Освободите животное, несущее микроскоп, в его домашнюю клетку или поведенческую камеру для акклиматизации и ожидайте отмена анестезии, если это применимо. Критический шаг. Обучите животных переносить вес микроскопа с помощью фиктивного микроскопа на несколько сеансов, пока не убедитесь, что ношение микроскопа не мешает их нормальному поведению перед началом экспериментальных сеансов. Регулярное обращение и тренировка для активного сна предотвратят чрезмерный стресс у животных. Выберите параметры сбора данных, которые будут использоваться для сбора данных. Это включает в себяСкорость передачи данных ( например, 20 кадров в секунду, коэффициент усиления 1 и мощность светодиода 50%). Проверьте гистограмму изображения при выборе параметров, чтобы обеспечить хорошее SNR. ПРИМЕЧАНИЕ. Числовая апертура для сбора флуоресценции составляет 0,35 для призма 1 мм по сравнению с 0,5 для 1 мм прямого зонда. Запустите поведенческое программное обеспечение и запрограммируйте его для запуска микроскопа в желаемом цикле записи изображений ( например , 4X 5 мин. ВКЛ. 2 мин. ВЫКЛ.). Подключите TTL-порт к NODUS IO к порту TRIG в поле DAQ через кабель RJ45-BNC. Поместите животное в поведенческую арену, если он еще не существует, и начните эксперимент. После получения желаемых данных повторно обезболивают животное с изофлураном (5% в кислороде) в индукционной камере или осторожно бодрствуют – удерживайте животное. Ослабьте установочный винт базовой пластины и отсоедините микроскоп от опорной плиты, осторожно потянув микроскоп. Замените крышку опорной плиты и аккуратно затяните baseplaTe комплект винт. Верните животное в домашнюю клетку до следующего сеанса записи. Используйте справочные флуоресцентные изображения в качестве руководства для последующих сеансов визуализации, чтобы вернуться в одно и то же поле зрения. 6. Оценка крупномасштабных данных изображения Ca 2+ Чтобы извлечь местоположение ячейки и динамику Ca 2+ в поле зрения из данных, можно использовать различные платформы анализа данных. Мозаика, платформа анализа данных, разработанная специально для обработки широкомасштабных фильмов с изображениями Ca 2+ , была использована для этого исследования здесь. Исправить дефектные пиксели и интерполировать любые отдельные отброшенные кадры в необработанных фильмах на этапе предварительной обработки. Загрузите изображения в пространстве с полного поля зрения 1440 x 1080 пикселей на 720 x 540 пикселей, чтобы уменьшить объем данных. Чтобы исправить артефакты движения в мозге относительно датчика изображения микроскопа, зарегистрируйте фильмы, используя строгие изображения на основе ImageJ reАлгоритм регистрации (TurboReg). Чтобы идентифицировать отдельные нейроны, повторно выразить изображения как относительные изменения флуоресценции ΔF / F 0 = FF 0 / F 0, где F 0 – среднее изображение, полученное путем усреднения всего фильма. Определите пространственные фильтры, соответствующие отдельным ячейкам, используя установленный алгоритм сортировки ячейки. Здесь мы использовали основной и индивидуальный анализ компонентов 21 для идентификации отдельных нейронов. ПРИМЕЧАНИЕ. Событие было определено, когда пиковая амплитуда события в трассе составляла более 8 стандартных отклонений от базовой линии трассы в нашем наборе данных, а данные о местоположении ячейки и данных динамики Ca 2+ были экспортированы для дальнейшего анализа.