ניתוח Immunofluorescence של גרגר מתח גיבוש לאחר האתגר בקטריאלי של תאים יונקים

ויזואליזציה של אינטראקציות בין מחוללי מארח-פתוגן ברמה התאית היא שיטה רבת עוצמה להשגת תובנות לגבי אסטרטגיות פתוגניות ולזיהוי מסלולים סלולריים מרכזיים. ואכן, פתוגנים יכולים לשמש כלים כדי לאתר מטרות או מבנים סלולריים חשובים, כמו פתוגנים התפתחו כדי לחתור התהליכים הסלולר המרכזי כאסטרטגיה ההישרדות שלהם או התפשטות. ויזואליזציה של רכיבים סלולריים יכולה להיות מושגת על ידי רקומביננטי להביע fluorescently מתויג חלבונים מארח. בעוד זה מאפשר ניתוח בזמן אמת, הדור של שורות תאים עם ספציפית מתויג חלבונים מארח הוא מאוד מייגע עלול לגרום לתופעות לוואי לא רצויות. יותר נוח הוא זיהוי של גורמים סלולריים באמצעות נוגדנים ספציפיים, כי גורמים מרובים המארח ניתן לנתח בו זמנית ואחד אינו מוגבל לסוג תא מסוים. החיסרון הוא רק תצוגת סטטי ניתן ללכוד כמו ניתוח immunofluorescence מחייב fixat תא המארחיוֹן. עם זאת, יתרון חשוב של הדמיה immunofluorescence היא שזה בקלות משאיל את עצמו הן ניתוח איכותי וכמותי. זה בתורו יכול לשמש כדי להשיג הבדלים משמעותיים מבחינה סטטיסטית כדי לספק תובנות חדשות אינטראקציות מארח פתוגן.

ניתוח פלורסנט תוכניות ניתוח הם כלי ניתוחי רב עוצמה לביצוע 3D ו 4 D ניתוח. עם זאת, העלות הגבוהה של התוכנה ותחזוקה שלה לעשות שיטות המבוססות על תוכנות קוד פתוח חינם יותר אטרקטיבי. ניתוח תמונה זהיר באמצעות ביו ניתוח תוכנה הוא בעל ערך כפי שהוא מבסס ניתוח ויזואלי, כאשר הקצאת משמעות סטטיסטית, מגביר את הביטחון בנכונות פנוטיפ נתון. בעבר, SGs נותחו באמצעות תוכנת ImageJ חינם, אשר מחייב זיהוי ידני של SGS ⁴ בודדים. כאן אנו מספקים פרוטוקול אינדוקציה וניתוח של SG SG הסלולר בהקשר של bacזיהומים טרליים באמצעות קוד פתוח חופשי ניתוח תמונה תוכנה ICY (http://icy.bioimageanalysis.org). תוכנת ניתוח ביו התמונה יש מובנית גלאי נקודה תוכנית כי הוא מתאים מאוד לניתוח SG. זה מאפשר כוונון עדין של תהליך זיהוי אוטומטי באזורים ספציפיים של ריבית (ROIs). זה מתגבר על הצורך בניתוח ידני של SGs הפרט מסיר הטיה הדגימה.

רבים סביבתיים מדגיש לגרום היווצרות של SGS, שהם שלב cytosolic צפופה שלב, מבנים שאינם קרום של 0.2 – 5 מיקרומטר בקוטר ^{5 , 6} . תגובה סלולרית זו נשמרת בצורה אבולוציונית בשמרים, בצמחים וביונקים, והיא מתרחשת כאשר תרגום החלבון העולמי מעוכב. זה כרוך צבירה של מתחמי היזום התרגום נתקע לתוך SGs, אשר נחשבים מקומות החזקת עבור mRNAs translationally-inactive, המאפשר תרגום סלקטיבי של קבוצת משנה של mRNAs הסלולר.עם הסרת הלחץ, SGs לפזר את שיעורי הגלובלית של סינתזת החלבון לחדש. SGs מורכבים תרגום התארכות גורמים הארכה, חלבונים המעורבים RNA מטבוליזם, RNA מחייב חלבונים, כמו גם חלבונים פיגומים וגורמים המעורבים תא המארח איתות ² , למרות ההרכב המדויק יכול להשתנות בהתאם ללחץ מוחל. גורמים סביבתיים אשר מעוררים היווצרות SG כוללים רעב חומצות אמינו, קרינה UV, הלם חום, הלם אוסמוטי, מתח reticulum endoplasmic, היפוקסיה וזיהום ויראלי ^{2 , 7 , 8} . התקדמות רבה נעשתה בהבנת האופן בו וירוסים מעוררים וגם מערערים את מבנה ה- SG, בעוד שרק מעט ידוע עדיין על האופן שבו פתוגנים אחרים, כגון פתוגנים, חיידקים פטרייתיים או פרוטוזנים, משפיעים על תגובת המתחים הסלולרית ^{1 , 7} .

שיגLla flexneri הוא גרם שלילי pathulative cytosolic הפתוגן של בני האדם ואת הגורם הסיבתי של שלשולים חמורים או shigellosis. Shigellosis הוא נטל בריאות הציבור העיקרי ומוביל 28,000 מקרי מוות בשנה אצל ילדים מתחת לגיל 5 של ^{9 , 10} . ס flexeneri מדביק את אפיתל הקולוני ומתפשט תא לתא ידי חטיפת המרכיבים cytoskeletal של המארח ^{11 , 12} . זיהום של אפיתל תומך שכפול של ס flexeneri בתוך cytosol אבל מקרופאגים נגועים למות דרך תהליך דלקתיות המוות הנקרא pyroptosis. זיהום מוביל לגיוס מסיבי של נויטרופילים ודלקת חמורה המלווה בחום, מתח חמצוני והרס רקמות. לכן, בעוד תאים נגועים כפופים ללחצים פנימיים המושרה על ידי זיהום, כגון הפרעות Golgi, מתח genotoxic ו סידור מחדש של cytoskeletalS, תאים נגועים הם גם נתון ללחץ סביבתי עקב תהליך דלקתי.

אפיון ההשפעה של זיהום S. flexneri על היכולת של תאים להגיב על מדגיש סביבתי באמצעות מספר סמנים SG הוכיח כי זיהום מוביל הבדלים איכותיים כמותיים הרכב SG ³ . עם זאת, מעט ידוע על פתוגנים חיידקים אחרים. כאן אנו מתארים מתודולוגיה של זיהום של תאים המארח עם הפתוגן cytosolic S. flexneri , הדגשת תאים עם מדגיש סביבתי שונים, תיוג של רכיבי SG, ואת ניתוח כמותי וכמותי של SG הרכב והרכב בהקשר של נגוע ותאים שאינם נגועים. שיטה זו מיושמת באופן נרחב פתוגנים חיידקים אחרים. בנוסף, ניתוח התמונה של היווצרות SG עשוי לשמש זיהומים על ידי וירוסים או פתוגנים אחרים. זה יכול לשמש כדי לנתח SGהיווצרות זיהום או השפעת זיהום על היווצרות SG בתגובה ללחץ אקסוגני.