Her presenterer vi en protokoll for å indusere toleranse i transplantasjon, og vurdere i vitro og i vivo undertrykkende kapasiteten til forskjellige celle undergrupper fra mottakeren og immunsystemet status mottakeren mot donor eller eksogene antigener.
Den største bekymringen i transplantasjon er å oppnå bestemte toleransegrenser gjennom induksjon av regulatoriske celler. Forståelsen av toleranse mekanismer krever pålitelig modeller. Her beskriver vi modeller toleranse til hjerte allograft i rotte, indusert blokade av costimulation signaler eller oppregulering av immunoregulatory molekyler gjennom genoverføring. Hver av disse modellene tillatt i vivo generasjon av regulatoriske celler som regulatoriske T-celler (Tregs), regulatoriske B-celler (Bregs) eller regulatoriske myeloide celler (RegMCs). I dette manuskriptet beskrive vi to utfyllende protokoller som er brukt til å identifisere og definere i vitro og vivo regulatoriske celle aktivitet for å finne deres ansvar i toleranse induksjon og vedlikehold. Først i vitro undertrykkende analysen tillatt rask identifikasjon av celler med undertrykkende kapasitet på effektor immunreaksjoner i en dose avhengige måte, og kan brukes for videre analyse som cytokin måling eller cytotoksisitet. Andre markert adoptivforeldre overføring av celler fra en tolerant behandlet mottaker til en nylig bestrålt podet mottaker, tolerogenic egenskapene til disse cellene i kontrollere pode regissert immunreaksjoner og/eller konvertering av nye regulatoriske celler ( kalt smittsomme toleranse). Disse metodene er ikke begrenset til celler med kjente fenotypiske markører og kan utvides til enhver celle befolkningen. Videre rettet donor allospecificity av regulatoriske celler (et viktig mål innen) kan vurderes ved hjelp av tredjeparts giver celler eller pode i vitro eller i vivo. Til slutt, for å finne bestemte tolerogenic kapasiteten på disse regulatoriske celler, vi gir for å vurdere humoral anti-giver antistoff svarene og kapasiteten til mottakeren å utvikle humoral svar mot nye eller tidligere kjent antigener. Modeller av toleranse beskrevet kan brukes til å karakterisere ytterligere regulatoriske celler, for å identifisere nye biomarkers og immunoregulatory molekyler, og kan tilpasses andre transplantasjon modeller eller autoimmune sykdommer i gnagere eller menneskelig.
CARDIAC allograft i rotte er en pålitelig organ transplantasjon modell å vurdere toleranse induksjon behandlinger, dechiffrere mekanismer for toleranse induksjon og vedlikehold, og har potensial til å indusere funksjonelt kompetente og dominerende regulatoriske celler. Protokollene nedenfor beskriver en fullt feil heterotopic hjerte pode fra Lewis 1W donor rotte (LEW.1W, RT1u) i en Lewis 1A mottaker rotten (LEW.1A, RT1en). I denne pode kombinasjon, akutt avvisning skjer raskt (i ca 7 dager) og kan lett bli vurdert av pode slo måling gjennom palpasjon over magen. Her foreslår vi tre protokoller for å indusere toleranse av cardiac allograft i rotte. I disse modellene, toleranse indusert og/eller vedlikeholdes av forskjellige regulatoriske celletyper. Første, blokkering av CD40-CD40L vekselsvirkningene med en adenovirus koding CD40Ig (AdCD40Ig) indusert generering av CD8+ Tregs kan indusere toleranse når adoptively overføres til podet mottakere1. Videre uttømming av CD8+ celler (med anti-CD8α antistoffer) i AdCD40Ig-behandlet mottakere genereres Bregs og RegMCs2. Analysering av CD8+ Tregs egenskaper valgte nøkkel flere immunoregulatory molekyler definert som interleukin-34 (IL-34) og Fibroleukin-2 (FGL-2)3,4,5,6 . Mens overuttrykte IL-34 (med en AAV vektor) indusert Tregs gjennom generasjon av RegMCs, indusert overuttrykte FGL-2 Bregs, underliggende komplekse nettverk av regulatoriske celler.
Fordi kronisk avvisning langsomt og er langsiktig, kreves en grundig analyse å skille toleranse mot kroniske avvisning. Pode er vanligvis vurdert for cellen infiltrasjon, fibrose, fortykkelse av vaskulære veggen og utfyller C4d deponering av immunohistology7. Mens histology metoder krever dyr offer eller pode biopsi, her beskriver vi en enkel metode for å vurdere ulike funksjonene i tolerert allograft: fremveksten og funksjon av regulatoriske celler og anti-giver spesifikt antistoff svar fra blod eksempel av flowcytometri (her, vi brukte fluorescens-aktivert celle sortering (FACS)).
Vedlikehold av toleranse i allograft etter arrestasjonen av behandling er vanligvis forbundet med induksjon av regulatoriske celler8. I de siste tiårene, studier fokuserte på CD4+Tregs enstemmig preget dem ved de sentrale Foxp3+CD25høyog CD127–9,10,11. Tilsvarende flere markører ble tilskrevet CD8+ Tregs, som CD122+, CD28–, CD45RClav, PD1+, og Helios1,12,13,14 , 15 , 16 , 17. over år, uttrykk for GITR og CTLA4 cytokiner (IL-10, TGFβ, IL-34, IL-35, FGL-2) var i tillegg knyttet til en Treg profil3,4,6,13, 18,19,20,21. Imidlertid nye regulatoriske celle populasjoner, som Bregs, RegMCs eller NKTregs, mangle relevante bestemte markører. Faktisk Bregs er hovedsakelig ferdigmeldt av umoden CD24+ celler, med tvetydig CD27 uttrykk og noen ganger produksjon av IL-10, TGFβ eller granzyme B22,23,24. Kompleksiteten i myelogen celle avstamning krever en kombinasjon av flere indikatorer som definerer sin regulerende eller proinflammatory profil som CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a eller CD16325,26. Endelig noen markører er rapportert å identifisere NKTregs som CD11b+, CD27+, TGFβ+, men flere studier trengs for å fremme svært beskrive dem27,28,29 ,30,31,32. Dermed bevis undertrykkende aktivitet må legitimere ytterligere fenotypiske beskrivelse for identifisering av nye biomarkers, nye immunoregulatory meglere, og å utvide omfanget til ny cellen terapi.
Vi foreslår to utfyllende metoder for å evaluere undertrykkende aktiviteten til cellene. Først i vitro metoden består av dyrking undertrykkende celler med merket effektor T celler stimulert av allogene donor antigen presentere celler (APCs) på forskjellige forhold over 6 dager, og analysere effektor T celle spredning som gjenspeiler donor-rettet uimottakelig undertrykkelse. Celler fra behandlet rotter kan sammenlignes direkte til celler fra naiv rotter og ikke-behandlet podet rotter undertrykkende aktivitet (eller andre regulerende celle befolkningen), i en rekke suppressor: effektor prosenter. Videre er denne metoden krever ikke noen transplantasjon, og får resultater innen 6 dager. Andre består metoden i vivo av overføre beregnet regulatoriske cellene fra rotte behandlet til en nylig bestrålt podet mottaker. Mens B celler, myeloide celler eller T celler fra ikke-behandlet naiv rotter er vanligvis hemme akutt avvisning og forlenge pode overlevelse ved adopsjon overføring, celler med kraftig undertrykkende aktivitet fra behandlet-mottakere har disse attributtene 1,2,3,4,33. Lymphopenia av bestråling av mottakeren bør la adoptively overførte celler forblir upåvirket av blod homeostase og mestre lettere immunreaksjoner anti-donor. For begge metoder, i vitro utnyttelsen av allogene tredjeparts APCs eller i vivo adoptivforeldre overføring av undertrykkende at cellene i mottakere podet med tredjeparts hjerte analyse av anti-giver spesifisitet. Mens metoden i vivo krever et betydelig antall celler, dårlig representert kan celle subpopulasjoner vurderes lettere for undertrykkende aktivitet i vitro33.
Humoral svar kan også måles for å vurdere tilstanden til toleranse og kontroll av regissert antistoff Svar å donor antigener. Faktisk kan toleranse være preget av fravær av humoral respons mot giveren men bevaring av kapasiteten for mottakerne å utvikle humoral respons til nye antigener og bevaring av minne svar. Først er prinsippet om alloantibody påvisning basert på anerkjennelse av donor cellene av mottakeren antistoffer etter inkubasjon av donor celle type med serum fra en podet mottaker. Andre, humoral respons til eksogene antigener kan være vurdert følgende stimulering av tolerant langtidsmottakere med nøkkelhullet albuskjell Hemocyanin (KLH) emulgert med komplett Freund’s adjuvant. Tilstedeværelsen av bestemte IgM og IgG-antistoffer mot antigener kan oppdages 4 og 13 dager, henholdsvis etter immunisering, med enzym koblede ImmunoSorbent analysen (ELISA)34. Tredje kan bevaring av immun minne svar vurderes ved injeksjon av xenogeneic røde blodlegemer (RBCs) dager -7 og 3 transplantasjon og RBCs farging med mottaker serum samlet dager 8 og +17 etter transplantasjon. Alle disse metodene tillater identifikasjon av immunglobulin subtyper med bestemte sekundære antistoffer, og raske oppkjøp av resultater i mindre enn 1,5 t av FACS flekker eller noen timer med ELISA.
Til slutt, disse protokollene er utviklet for karakteristikk av transplantasjon modeller, og kan, i noen grad, gjelder autoimmun sykdom modeller. Prinsippene for metoden kan transponeres til alle arter.
Adopsjon overføringen av totale splenocytes i en nylig podet mottaker er en effektiv måte å oppdage tilstedeværelsen av regulatoriske celler indusert eller kraftig av behandling. Verten bestråling-indusert forbigående lymphopenia fremmer celle overlevelse etter overføring og etablering av toleranse. Videre gir sub dødelige bestråling tid for celler med tolerogenic egenskaper til å konvertere til nye regulatoriske celler under immune rekonstituering, et fenomen som kalles smittsomme toleranse34…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble realisert i sammenheng med Labex IGO prosjektet (n ° ANR-11-LABX-0016-01) som en del av “Investissements d’Avenir” franske regjering programmet administreres av ANR (ANR-11-LABX-0016-01) og IHU-Cesti prosjektet finansiert også av den ” Investissements d’Avenir”franske regjering program, administrert av den franske National Research Agency (ANR) (ANR-10-IBHU-005). IHU-Cesti prosjektet er også støttet av Nantes Métropole og Région Pays de la Loire.
animals | |||
LEW.1W and LEW.1A rats | Janvier Labs, France | 8 weeks old, | |
BN third party donor rats | Janvier Labs, France | 8 weeks old, | |
nom | company | catalogue number | comments |
reagents | |||
AdCD40Ig | Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France | home made plasmids | |
IL34-AAV | Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France | home made plasmids | |
FGL2-AAV | Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France | home made plasmids | |
anti-TCR | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | R7/3 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD25 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX39 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD8 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX8 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD45RA | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX33 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD161 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | 3.2.3 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD11b/c | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX42 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-TCRgd | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | V65 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD45RC | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX22 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD4 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX35 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD45R | BD Biosciences, Mountain View, CA | #554881, His24 clone | |
anti-rat IgG-FITC | Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA | #112-096-071 | |
anti-rat IgG1 | Serotec | #MCA 194 | |
anti-rat IgG2a | Serotec | #MCA 278 | |
anti-rat IgG2b | Serotec | #MCA 195 | |
anti-rat IgM-FITC | Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA | #115-095-164 | |
streptavidin HRP | BD Biosciences, Mountain View, CA | #554066 | |
KLH | Sigma Aldrich, St. Louis, USA | #9013-72-3 | |
PBS 1X | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | Phosphate Buffer Solution without calcium and magnesium, | |
Tween 20 | Sigma, Saint-Louis, USA | #9005-64-5 | |
TMB substrate reagent kit | BD Biosciences, Mountain View, CA | #555214 | |
CellTraceTM CFSE cell proliferation kit | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #C34554 | |
RPMI 1640 medium 1X | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #31870-025 | |
penicilline streptomycine | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #15140-122 | |
Hepes Buffer | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #15630-056 | |
non essential amino acids | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #11140-035 | |
Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #11360-039 | |
2 beta mercaptoethanol | Sigma, Saint-Louis, USA | #M3148 | |
Cell Proliferation Dye eFluor® 450 Cell | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #65-0842-85 | |
Glutamine | Sigma, Saint-Louis, USA | #G3126 | |
DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #D1306 | |
Collagenase D | Roche Diagnostics, Germany | #11088882001 | |
EDTA | Sigma, Saint-Louis, USA | #E5134 | |
NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | #B230561 | |
Magnetic dynabeads | Dynal, Invitrogen | #11033 | Goat anti-mouse IgG |
One Comp eBeads | Ebiosciences, San Diego, USA | #01-1111-42 | |
Betadine | Refer to the institutional guidelines | ||
Isoflurane | Refer to the institutional guidelines | ||
Naplbuphine | Refer to the institutional guidelines | ||
Terramycine | Refer to the institutional guidelines | ||
Buprenorphine | Refer to the institutional guidelines | ||
Meloxicam | Refer to the institutional guidelines | ||
Complete Freund's adjuvant | |||
Rompun | Refer to the institutional guidelines | ||
Ringer lactate | Refer to the institutional guidelines | ||
Ketamine | Refer to the institutional guidelines | ||
Red blood cell lysis solution | Dilute 8,29g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) and 37.2mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) in 800ml H2O. Adjust pH to 7.2-7.4 and complete to 1L with H2O. | ||
Collagenase D | Dilute 1g collagenase in 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS | ||
PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%) | Add 5 mL EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) and 20ml FCS to 1ml PBS 1X | ||
CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen) | Dilute 50µg (=1 vial) of CFDA SE (component A) in 90μl DMSO (component B) solution to obtain a 10mM stock solution. Then, dilute stock solution at 1/20 000 in PBS 1X to obtain a 0.5μM solution | ||
complete medium for coculture | 500ml complete RPMI-1640 medium with 5 ml Penicillin (80 unit/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml L-Glutamine, 5 ml Non Essential Amino Acids (100X), 5ml Pyruvate Sodium (100mM), 5 ml HEPES buffer (1M), 2.5 ml b mercaptomethanol (7 ml of 2-bmercaptoethanol stock diluted in 10 ml RPMI), 10% FCS | ||
nom | company | catalog number | comments |
equipments | |||
falcon 50ml | BD Biosciences, Mountain View, CA | #227261 | |
falcon 15ml | BD Biosciences, Mountain View, CA | #188271 | |
sieve | |||
Corning plastic culture dishes | VWR, Pessac | #391-0439 | |
100µm and 60µm tissue filters | Sefar NITEX, Heiden, Switzerland | #03-100/44 and #03-60/35 | |
96 wells U bottom plates for coculture | Falcon U-bottom Tissue Culture plate, sterile, Corning | #353077 | |
96 wells V bottom plates for FACS staining | ThermoScientifique, Danemark | #249570 | |
96 wells flat bottom ELISA plates | Nunc Maxisorb | ||
seringue for spleen crush | BD Biosciences, Mountain View, CA | #309649 | |
ELISA reader | SPARK 10M, Tecan, Switzerland | SPARK 10M, Tecan, Switzerland | |
centrifuge | |||
bain marie | |||
X rays irradiator | Lincolshire, England | Faxitron CP160 | |
solar agitator | |||
FACS Canto II | BD Biosciences, Mountain View, CA | ||
FACS Aria II | BD Biosciences, Mountain View, CA | ||
magnet | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | 12302D |