In Vitro и In Vivo Оценка T, B и миелоидных клеток подавляющих активность и гуморальные ответы от пересадки получателей

Аллотрансплантата сердца крыс представляет собой надежный орган трансплантации модель для оценки лечения индукции толерантности, чтобы расшифровать механизмы индукции толерантности и обслуживания и имеет потенциал, чтобы побудить функционально компетентным и доминирующей регуляторных клеток. Протоколы ниже описывают полностью несоответствие heterotopic сердечного трансплантата из крыса доноров 1W Льюис (LEW.1W, RT1^u) в Льюис 1A получателей крысу (LEW.1A, RT1). В этом сочетании трансплантата острый отказ происходит быстро (около 7 дней) и может быть легко оценены трансплантата, победив измерения посредством пальпации живота. Здесь мы предлагаем три протокола, чтобы стимулировать толерантность к аллотрансплантата сердца крыс. В этих моделях терпимость является индуцированных или поддерживаемых типов различных регулирующих клеток. Во-первых, блокирование CD40-CD40L взаимодействий с аденовирус кодирования CD40Ig (AdCD40Ig) индуцированной поколения CD8⁺ Tregs, способны индуцировать толерантность когда восприимчивую переданы вторичных получателей привитые¹. Кроме того истощение CD8⁺ клеток (с антител анти CD8α) в AdCD40Ig-лечение получателей генерируется Bregs и RegMCs². Глубокий анализ CD8⁺ Tregs свойства подчеркнул ключевую роль несколько иммунорегуляторное молекул определяется как интерлейкин-34 (IL-34) и Fibroleukin-2 (FGL-2)^3,4,5,6 . В то время как гиперэкспрессия Ил-34 (с вектора AAV) индуцированных Tregs через поколения RegMCs, гиперэкспрессия FGL-2 индуцированных Bregs, лежащие в основе сложной сети регуляторных клеток.

Потому что хронический отказ развивается медленно и долгосрочные, углубленный анализ требуется различать терпимость против хронического отказа. Трансплантата обычно оценивается для клеток инфильтрата, фиброз, утолщение сосудистой стенки и дополнения C4d осаждения immunohistology⁷. Хотя гистология методы требуют жертвоприношения животных или графт биопсии, здесь мы опишем простой метод для оценки различных характеристик переносится аллотрансплантата: Эмерджентность и функция регуляторных клеток и ответы специфическое антитело против доноров крови Образец подачей cytometry (здесь, мы использовали активирован флуоресценции клеток, сортируя (FACS)).

Поддержание толерантности к аллотрансплантата после ареста лечения обычно ассоциируется с индукции регуляторных клеток⁸. В последние десятилетия, исследования фокусировались на CD4⁺Tregs единогласно характеризуется их ключевых маркеров Foxp3⁺, CD25^{высокий}и CD127^–9,10,11. Аналогичным образом, несколько маркеров были приписаны CD8⁺ Tregs, как CD122⁺, CD28^–, CD45RC^низкий, PD1⁺и Гелиос^{+ 1,12,13,14 , 15 , 16 , 17}. за годы, выражение ГИТР, CTLA4 и цитокинов (Ил-10, TGFβ, Ил-34, IL-35, FGL-2) были дополнительно подключены к Treg профиль^{3,4,6,13, 18,19,,2021}. Однако новые нормативные клеточных популяций, например Bregs, RegMCs или NKTregs, отсутствие соответствующих конкретных маркеров. Действительно, Bregs главным образом помечаются как незрелые CD24⁺ клеток, с неоднозначной CD27 выражение, а иногда и производства Ил-10, TGFβ, или Гранзим B^22,23,24. Сложность линии миелоидных клеток требуется сочетание нескольких маркеров, чтобы определить их регулирования или провоспалительных профиль например CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a или CD163^25,26. Наконец, были зарегистрированы некоторые маркеры для выявления NKTregs например CD11b⁺, CD27⁺, TGFβ⁺, но больше исследования необходимы для дальнейшего фенотипически описания их^{27,28,29 ,30,,3132}. Таким образом, для дальнейшей легитимизации фенотипического описания для идентификации нового биомаркерами, требуются свидетельства подавляющих деятельность новых иммунорегуляторное посредников и расширить сферу для новой клеточной терапии.

Мы предлагаем два взаимодополняющих методов оценки подавляющих активность клеток. Во-первых, в пробирке метод состоит из культивирования подавляющие клетки с метками эффекторных T клеток стимулируется аллогенной доноров антиген представляющих клеток (БТР) в различных соотношениях более 6 дней, и анализируя эффекторные T мобильных распространения, отражает доноров направленных иммуносупрессия. Клетки из очищенных крыс можно сравнить непосредственно на клетки от крыс наивными и не лечить привитые крыс для подавляющих активность (или любой другой популяции регулирования клеток), в диапазоне соотношений подавитель: эффекторные. Кроме того этот метод не требует каких-либо трансплантации, и результаты будут получены в течение 6 дней. Во-вторых метод в vivo состоит из передачи предполагаемой регуляторных клеток из обработанных крыса недавно облученного привитые получателю. В то время как клетки B, миелоидные клетки или Т-клеток от крыс-лечение наивно обычно не в состоянии препятствовать острый неприятие и продлить трансплантата выживание после приемных передачи, клетки с потенцируется подавляющих активность от лечение получатели имеют эти атрибуты ^1,–^2,–^3,–^4,–³³. Лимфопения, индуцированных облучением получателя рекомендуется разрешить восприимчивую передаваемых клетки остаются незатронутыми гомеостаз крови и освоить более легко анти доноров иммунных реакций. Для обоих методов, в пробирке использования аллогенной сторонние БТРы или в естественных условиях приемных передачи подавляющие клетки в получателей, привитый сердцем сторонних позволяют анализ специфики анти доноров. В то время как в естественных условиях метода требуется значительное количество клеток, слабо представлены подавляющих активность в vitro³³субпопуляции клеток может оцениваться более легко.

Гуморальные ответы также может быть измерена оценить состояние терпимости и управления направленной антитела ответов доноров антигены. Действительно терпимость может характеризоваться отсутствие гуморального иммунного ответа сторону доноров, но сохранение потенциала для получателей разрабатывать гуморальный ответ на новые антигены и сохранение памяти ответов. Во-первых принцип обнаружения alloantibody основана на признании клеток донора получателей антител после инкубации типа клеток донора с сывороткой от привитых получателя. Во-вторых, гуморальные ответы, направленные Экзогенные антигены может быть начисленных следующие стимуляции долгосрочных терпимая(ый) получателей с Keyhole Гемоцианин магнитные (KLH), эмульсии с полным Фройнд в адъювантной. Присутствие специфических IgM и IgG антител против антигенов могут быть обнаружены 4 и 13 дней, соответственно, после иммунизации, с фермента связанных Assay иммуносорбента (ELISA)³⁴. В-третьих сохранение иммунной памяти ответов можно оценить путем инъекций культивированная красных кровяных телец (эритроцитов) дней -7 и + 3 RBCs, окрашивание с получателя сыворотки, собранных в дни + 8 и + 17, после пересадки и трансплантации. Все эти методы позволяют для выявления иммуноглобулинов подтипы, используя вторичные антитела и быстрое приобретение результаты в менее чем 1,5 h СУИМ пятнать или через несколько часов по ELISA.

Наконец эти протоколы предназначены для характеризации трансплантации модели и может быть, в некоторой степени, применяемые к моделям аутоиммунных заболеваний. Принципы метода может быть перенесен на всех видов.