Aquí, presentamos un protocolo para inducir tolerancia en el trasplante y evaluar in vitro e in vivo la capacidad supresora de subconjuntos distintos de la célula del receptor y el estado inmune del receptor hacia el donante o los antígenos exógenos.
La principal preocupación en el trasplante es lograr tolerancia específica a través de la inducción de células reguladoras. La comprensión de los mecanismos de tolerancia requiere modelos confiables. Aquí, describimos los modelos de la tolerancia al aloinjerto cardiaco de rata, inducido por el bloqueo de señales de coestimulación o upregulation de moléculas inmunorreguladoras a través de la transferencia de genes. Cada uno de estos modelos permite en vivo la generación de células reguladoras como las células T reguladoras (Tregs), las células B reguladoras (Bregs) o células mieloides reglamentarias (RegMCs). En este manuscrito, Describimos dos protocolos complementarios que se han utilizado para identificar y definir la actividad reguladora celular in vitro e in vivo para determinar su responsabilidad en la inducción de la tolerancia y mantenimiento. En primer lugar, un ensayo represivo en vitro permite la identificación rápida de las células con capacidad supresora de la respuesta inmune efectora una manera dosis dependiente y puede ser utilizado para otros análisis como medición de citocinas o citotoxicidad. En segundo lugar, la transferencia adoptiva de células desde un recipiente tratado tolerante a un destinatario injertado recién irradiado, destacó las propiedades tolerogénicas de estas células en el control de las respuestas inmunes del injerto dirigida o conversión (nuevo) las células reguladoras había llamado tolerancia infecciosa). Estos métodos no están restringidos a las células con marcadores fenotípicos conocidos y pueden ser extendidos a cualquier población de la célula. Además, donante dirigido allospecificity de células reguladoras (una meta importante en el campo) puede evaluarse mediante el uso de células de donante tercero o injerto in vitro o en vivo. Finalmente, para determinar la capacidad de tolerogénicas específicos de estas células reguladoras, le ofrecemos protocolos para evaluar las respuestas de anticuerpos humorales de anti- donantes y la capacidad del destinatario para desarrollar la respuesta humoral contra antígenos conocidos nuevo o antiguo. Los modelos de tolerancia descrito pueden ser utilizados para caracterizar las células reguladoras, para identificar nuevos biomarcadores y moléculas inmunoreguladoras y son adaptables a otros modelos de trasplante o enfermedades autoinmunes en roedores o humanos.
Aloinjerto cardiaco de rata es un modelo de trasplante de órgano confiable para evaluar tratamientos de inducción de tolerancia, para descifrar los mecanismos de inducción de la tolerancia y el mantenimiento y tiene el potencial para inducir las células reguladoras funcionalmente competentes y dominantes. Los protocolos a continuación describen un completamente desajuste heterotópico cardíaco injerto de una rata de donantes de 1W de Lewis (LEW.1W, RT1u) en una rata de receptores 1A de Lewis (LEW.1A, RT1una). En esta combinación de injerto, el rechazo agudo se produce rápidamente (en cerca de 7 días) y puede evaluarse fácilmente por injerto a medida a través de la palpación del abdomen. Aquí proponemos tres protocolos para inducir la tolerancia para el aloinjerto cardiaco de rata. En estos modelos, tolerancia es inducida o mantenida por tipos de células reguladoras diferentes. En primer lugar, el bloqueo de la interacción CD40-CD40L con un adenovirus codificación CD40Ig (AdCD40Ig) inducida por la generación de CD8+ Tregs capaces de inducir tolerancia cuando eventualmente transferido a recipientes injertada secundaria1. Además, el agotamiento de CD8 células+ (con anticuerpos anti-CD8α) en los receptores tratados con AdCD40Ig generados Bregs y RegMCs2. Análisis profundo de CD8+ Tregs propiedades destacan el papel clave de varias moléculas inmunoreguladoras definidas como interleucina-34 (IL-34) y Fibroleukin-2 (FGL-2)3,4,5,6 . Mientras que la sobreexpresión de IL-34 (con un vector AAV) inducida por Tregs a través de la generación de RegMCs, la sobreexpresión de FGL-2 inducida por Bregs, subyacente a la compleja red de células reguladoras.
Porque rechazo crónico se desarrolla lentamente y es a largo plazo, un análisis en profundidad es necesaria para distinguir la tolerancia frente a rechazo crónico. Injerto generalmente se evalúa por la infiltración celular, fibrosis, engrosamiento de la deposición de C4d vascular de la pared y complemento por immunohistology7. Mientras que la histología métodos requieren el sacrificio de animales o biopsia de injerto, aquí describimos un método simple para evaluar diversas características de aloinjerto tolerado: la aparición y función de las células reguladoras y las respuestas de anticuerpos específicos anti-donantes de sangre muestra mediante citometría de flujo (aquí hemos utilizado celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación).
Mantenimiento de la tolerancia a los aloinjertos tras detención del tratamiento es generalmente asociado con la inducción de células reguladoras8. En las últimas décadas, los estudios se centraron en CD4+Tregs caracterizado por unanimidad ellos por los principales marcadores Foxp3+,altade CD25 y CD127–9,10,11. Del mismo modo, varios marcadores fueron atribuidos a CD8+ Tregs, como CD122+, CD28–, CD45RCbaja, PD1+y Helios+ 1,12,13,14 , 15 , 16 , 17. sobre los años, la expresión de GITR, CTLA4 y citocinas (IL-10, TGFβ, IL-34, 35 IL, FGL-2) se asocian además a un Treg perfil3,4,6,13, 18,19,20,21. Sin embargo, nuevas poblaciones de células reguladoras, como Bregs, RegMCs, NKTregs, carecen de marcadores específicos pertinentes. De hecho, Bregs divulgan sobre todo como inmaduros CD24+ de las células, con la expresión ambigua de CD27 y a veces la producción de IL-10 y TGFβ granzima B22,23,24. La complejidad del linaje celular mieloide requiere una combinación de varios marcadores para definir su perfil regulatorio o proinflamatorias tales como el CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a o CD16325,26. Por último, se han divulgado algunos marcadores para identificar NKTregs como CD11b+, CD27+, TGFβ+, pero más estudios son necesarios más fenotípicamente describirlos27,28,29 ,30,31,32. Por lo tanto, se requieren evidencias de actividad supresora legitimar aún más la descripción fenotípica para la identificación de nuevos biomarcadores, nuevos mediadores inmunoreguladoras y ampliar el alcance a nuevas terapias con células madre.
Proponemos dos métodos complementarios para evaluar la actividad supresora de las células. En primer lugar, el método en vitro consta de prevencion células con células de etiqueta efectoras T estimuladas por antígenos alogénicos de donante que presenta las células (APCs) en diferentes proporciones durante 6 días de cultivo, y analizando el efector proliferación de la célula de T que refleja supresión inmune dirigida por el donante. Las células procedentes de ratas tratadas pueden compararse directamente a las células ingenuas ratas y ratas injertadas no tratadas para la actividad represiva (o a cualquier otra población de células reguladoras), en una gama de cocientes del supresor: efector. Además, este método no requiere ningún trasplante, y se obtienen resultados dentro de 6 días. En segundo lugar, el método en vivo consiste en transferir las células reguladoras previstas de una rata tratada a un destinatario injertado recién irradiado. Mientras que las células B, células mieloides o T las células de las ratas no tratadas ingenuo generalmente no para inhibir el rechazo agudo y prolongar la supervivencia del injerto a transferencia adoptiva, las células con actividad supresora potenciada de receptores tratados tienen estos atributos 1,2,3,4,33. Linfopenia inducida por la irradiación del destinatario se recomienda permitir eventualmente transferidas células siguen siendo inafectadas por la homeostasis de la sangre y dominar más fácilmente las respuestas inmunes de los donantes. Para ambos métodos, la utilización en vitro de allogeneic de terceros APC o en vivo la transferencia adoptiva de prevencion las células en los receptores injertados con un corazón de terceros permiten análisis de la especificidad de los donante. Considerando que el método en vivo requiere un número considerable de células, poco representado las subpoblaciones de células pueden evaluarse más fácilmente actividad supresora en vitro33.
Respuesta humoral también puede ser medido para evaluar el estado de la tolerancia y el control de las respuestas de anticuerpos dirigidos a los antígenos del donante. De hecho, la tolerancia se caracteriza por la ausencia de la respuesta humoral hacia el donante sino la conservación de la capacidad de los beneficiarios a desarrollar la respuesta humoral a antígenos nuevos y preservación de las respuestas de memoria. En primer lugar, el principio de la detección del aloanticuerpo se basa en el reconocimiento de las células del donante por receptores anticuerpos tras incubación del tipo de la célula donante con el suero del receptor injertado. Segunda respuestas humorales a antígenos exógenos pueden ser evaluados después del estímulo de receptores tolerantes a largo plazo con hemocianina de Lapa de ojo de la cerradura (KLH) emulsionado con completa adyuvante de Freund de. La presencia de anticuerpos IgM e IgG específicos contra los antígenos puede detectarse los días 4 y 13, respectivamente, después de la inmunización, con ensayo de inmunosorbente vinculado enzima (ELISA)34. En tercer lugar, la preservación de la respuesta inmune de memoria puede ser evaluada por la inyección de xenogeneicos de glóbulos rojos (gr) a -7 y + 3 días del trasplante y la tinción con destinatario suero de recolectadas en días + 8 y + 17 después del trasplante de glóbulos rojos. Todos estos métodos permiten la identificación de subtipos de inmunoglobulinas mediante anticuerpos específicos de la secundarios y adquisición rápida de los resultados en menos de 1,5 h por la FACS coloración o unas horas por ELISA.
Finalmente, estos protocolos están diseñados para la caracterización de los modelos de trasplante y pueden ser, en cierta medida, aplicada a los modelos de enfermedad autoinmune. Los principios del método pueden transponerse a todas las especies.
Transferencia adoptiva de esplenocitos totales en un destinatario recién injertado es una manera eficiente de detectar la presencia de células reguladoras inducidas o potenciada por un tratamiento. Linfopenia transitoria inducida por la irradiación de host promueve supervivencia de la célula después de la transferencia y establecimiento de la tolerancia. Por otra parte, el letal irradiación deja tiempo para las células con propiedades tolerogénicas para convertir a las nuevas células reguladoras durante la recon…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue realizado en el contexto del proyecto Labex IGO (n ° ANR-11-LABX-0016-01) que es parte del programa de gobierno francés “Investissements Avenir” administrado por la ANR (ANR-11-LABX-0016-01) y por el proyecto IHU-Cesti financiado también por el ” Programa de gobierno francés investissements Avenir”, gestionado por la Agencia de investigación nacional de francés (ANR) (ANR-10-IBHU-005). El proyecto IHU-Cesti es apoyado también por Nantes Métropole y Région Pays de la Loire.
animals | |||
LEW.1W and LEW.1A rats | Janvier Labs, France | 8 weeks old, | |
BN third party donor rats | Janvier Labs, France | 8 weeks old, | |
nom | company | catalogue number | comments |
reagents | |||
AdCD40Ig | Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France | home made plasmids | |
IL34-AAV | Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France | home made plasmids | |
FGL2-AAV | Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France | home made plasmids | |
anti-TCR | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | R7/3 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD25 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX39 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD8 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX8 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD45RA | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX33 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD161 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | 3.2.3 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD11b/c | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX42 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-TCRgd | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | V65 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD45RC | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX22 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD4 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX35 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD45R | BD Biosciences, Mountain View, CA | #554881, His24 clone | |
anti-rat IgG-FITC | Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA | #112-096-071 | |
anti-rat IgG1 | Serotec | #MCA 194 | |
anti-rat IgG2a | Serotec | #MCA 278 | |
anti-rat IgG2b | Serotec | #MCA 195 | |
anti-rat IgM-FITC | Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA | #115-095-164 | |
streptavidin HRP | BD Biosciences, Mountain View, CA | #554066 | |
KLH | Sigma Aldrich, St. Louis, USA | #9013-72-3 | |
PBS 1X | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | Phosphate Buffer Solution without calcium and magnesium, | |
Tween 20 | Sigma, Saint-Louis, USA | #9005-64-5 | |
TMB substrate reagent kit | BD Biosciences, Mountain View, CA | #555214 | |
CellTraceTM CFSE cell proliferation kit | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #C34554 | |
RPMI 1640 medium 1X | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #31870-025 | |
penicilline streptomycine | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #15140-122 | |
Hepes Buffer | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #15630-056 | |
non essential amino acids | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #11140-035 | |
Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #11360-039 | |
2 beta mercaptoethanol | Sigma, Saint-Louis, USA | #M3148 | |
Cell Proliferation Dye eFluor® 450 Cell | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #65-0842-85 | |
Glutamine | Sigma, Saint-Louis, USA | #G3126 | |
DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #D1306 | |
Collagenase D | Roche Diagnostics, Germany | #11088882001 | |
EDTA | Sigma, Saint-Louis, USA | #E5134 | |
NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | #B230561 | |
Magnetic dynabeads | Dynal, Invitrogen | #11033 | Goat anti-mouse IgG |
One Comp eBeads | Ebiosciences, San Diego, USA | #01-1111-42 | |
Betadine | Refer to the institutional guidelines | ||
Isoflurane | Refer to the institutional guidelines | ||
Naplbuphine | Refer to the institutional guidelines | ||
Terramycine | Refer to the institutional guidelines | ||
Buprenorphine | Refer to the institutional guidelines | ||
Meloxicam | Refer to the institutional guidelines | ||
Complete Freund's adjuvant | |||
Rompun | Refer to the institutional guidelines | ||
Ringer lactate | Refer to the institutional guidelines | ||
Ketamine | Refer to the institutional guidelines | ||
Red blood cell lysis solution | Dilute 8,29g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) and 37.2mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) in 800ml H2O. Adjust pH to 7.2-7.4 and complete to 1L with H2O. | ||
Collagenase D | Dilute 1g collagenase in 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS | ||
PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%) | Add 5 mL EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) and 20ml FCS to 1ml PBS 1X | ||
CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen) | Dilute 50µg (=1 vial) of CFDA SE (component A) in 90μl DMSO (component B) solution to obtain a 10mM stock solution. Then, dilute stock solution at 1/20 000 in PBS 1X to obtain a 0.5μM solution | ||
complete medium for coculture | 500ml complete RPMI-1640 medium with 5 ml Penicillin (80 unit/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml L-Glutamine, 5 ml Non Essential Amino Acids (100X), 5ml Pyruvate Sodium (100mM), 5 ml HEPES buffer (1M), 2.5 ml b mercaptomethanol (7 ml of 2-bmercaptoethanol stock diluted in 10 ml RPMI), 10% FCS | ||
nom | company | catalog number | comments |
equipments | |||
falcon 50ml | BD Biosciences, Mountain View, CA | #227261 | |
falcon 15ml | BD Biosciences, Mountain View, CA | #188271 | |
sieve | |||
Corning plastic culture dishes | VWR, Pessac | #391-0439 | |
100µm and 60µm tissue filters | Sefar NITEX, Heiden, Switzerland | #03-100/44 and #03-60/35 | |
96 wells U bottom plates for coculture | Falcon U-bottom Tissue Culture plate, sterile, Corning | #353077 | |
96 wells V bottom plates for FACS staining | ThermoScientifique, Danemark | #249570 | |
96 wells flat bottom ELISA plates | Nunc Maxisorb | ||
seringue for spleen crush | BD Biosciences, Mountain View, CA | #309649 | |
ELISA reader | SPARK 10M, Tecan, Switzerland | SPARK 10M, Tecan, Switzerland | |
centrifuge | |||
bain marie | |||
X rays irradiator | Lincolshire, England | Faxitron CP160 | |
solar agitator | |||
FACS Canto II | BD Biosciences, Mountain View, CA | ||
FACS Aria II | BD Biosciences, Mountain View, CA | ||
magnet | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | 12302D |