In Vitro e In Vivo la evaluación de la actividad supresora T, B y las células mieloides y las respuestas humorales de los receptores de trasplante

Aloinjerto cardiaco de rata es un modelo de trasplante de órgano confiable para evaluar tratamientos de inducción de tolerancia, para descifrar los mecanismos de inducción de la tolerancia y el mantenimiento y tiene el potencial para inducir las células reguladoras funcionalmente competentes y dominantes. Los protocolos a continuación describen un completamente desajuste heterotópico cardíaco injerto de una rata de donantes de 1W de Lewis (LEW.1W, RT1^u) en una rata de receptores 1A de Lewis (LEW.1A, RT1^una). En esta combinación de injerto, el rechazo agudo se produce rápidamente (en cerca de 7 días) y puede evaluarse fácilmente por injerto a medida a través de la palpación del abdomen. Aquí proponemos tres protocolos para inducir la tolerancia para el aloinjerto cardiaco de rata. En estos modelos, tolerancia es inducida o mantenida por tipos de células reguladoras diferentes. En primer lugar, el bloqueo de la interacción CD40-CD40L con un adenovirus codificación CD40Ig (AdCD40Ig) inducida por la generación de CD8⁺ Tregs capaces de inducir tolerancia cuando eventualmente transferido a recipientes injertada secundaria¹. Además, el agotamiento de CD8 células⁺ (con anticuerpos anti-CD8α) en los receptores tratados con AdCD40Ig generados Bregs y RegMCs². Análisis profundo de CD8⁺ Tregs propiedades destacan el papel clave de varias moléculas inmunoreguladoras definidas como interleucina-34 (IL-34) y Fibroleukin-2 (FGL-2)^3,4,5,6 . Mientras que la sobreexpresión de IL-34 (con un vector AAV) inducida por Tregs a través de la generación de RegMCs, la sobreexpresión de FGL-2 inducida por Bregs, subyacente a la compleja red de células reguladoras.

Porque rechazo crónico se desarrolla lentamente y es a largo plazo, un análisis en profundidad es necesaria para distinguir la tolerancia frente a rechazo crónico. Injerto generalmente se evalúa por la infiltración celular, fibrosis, engrosamiento de la deposición de C4d vascular de la pared y complemento por immunohistology⁷. Mientras que la histología métodos requieren el sacrificio de animales o biopsia de injerto, aquí describimos un método simple para evaluar diversas características de aloinjerto tolerado: la aparición y función de las células reguladoras y las respuestas de anticuerpos específicos anti-donantes de sangre muestra mediante citometría de flujo (aquí hemos utilizado celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación).

Mantenimiento de la tolerancia a los aloinjertos tras detención del tratamiento es generalmente asociado con la inducción de células reguladoras⁸. En las últimas décadas, los estudios se centraron en CD4⁺Tregs caracterizado por unanimidad ellos por los principales marcadores Foxp3⁺,^altade CD25 y CD127^–9,10,11. Del mismo modo, varios marcadores fueron atribuidos a CD8⁺ Tregs, como CD122⁺, CD28^–, CD45RC^baja, PD1⁺y Helios^{+ 1,12,13,14 , 15 , 16 , 17}. sobre los años, la expresión de GITR, CTLA4 y citocinas (IL-10, TGFβ, IL-34, 35 IL, FGL-2) se asocian además a un Treg perfil^{3,4,6,13, 18,19,20,21}. Sin embargo, nuevas poblaciones de células reguladoras, como Bregs, RegMCs, NKTregs, carecen de marcadores específicos pertinentes. De hecho, Bregs divulgan sobre todo como inmaduros CD24⁺ de las células, con la expresión ambigua de CD27 y a veces la producción de IL-10 y TGFβ granzima B^22,23,24. La complejidad del linaje celular mieloide requiere una combinación de varios marcadores para definir su perfil regulatorio o proinflamatorias tales como el CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a o CD163^25,26. Por último, se han divulgado algunos marcadores para identificar NKTregs como CD11b⁺, CD27⁺, TGFβ⁺, pero más estudios son necesarios más fenotípicamente describirlos^{27,28,29 ,30,31,32}. Por lo tanto, se requieren evidencias de actividad supresora legitimar aún más la descripción fenotípica para la identificación de nuevos biomarcadores, nuevos mediadores inmunoreguladoras y ampliar el alcance a nuevas terapias con células madre.

Proponemos dos métodos complementarios para evaluar la actividad supresora de las células. En primer lugar, el método en vitro consta de prevencion células con células de etiqueta efectoras T estimuladas por antígenos alogénicos de donante que presenta las células (APCs) en diferentes proporciones durante 6 días de cultivo, y analizando el efector proliferación de la célula de T que refleja supresión inmune dirigida por el donante. Las células procedentes de ratas tratadas pueden compararse directamente a las células ingenuas ratas y ratas injertadas no tratadas para la actividad represiva (o a cualquier otra población de células reguladoras), en una gama de cocientes del supresor: efector. Además, este método no requiere ningún trasplante, y se obtienen resultados dentro de 6 días. En segundo lugar, el método en vivo consiste en transferir las células reguladoras previstas de una rata tratada a un destinatario injertado recién irradiado. Mientras que las células B, células mieloides o T las células de las ratas no tratadas ingenuo generalmente no para inhibir el rechazo agudo y prolongar la supervivencia del injerto a transferencia adoptiva, las células con actividad supresora potenciada de receptores tratados tienen estos atributos ^1,2,3,4,33. Linfopenia inducida por la irradiación del destinatario se recomienda permitir eventualmente transferidas células siguen siendo inafectadas por la homeostasis de la sangre y dominar más fácilmente las respuestas inmunes de los donantes. Para ambos métodos, la utilización en vitro de allogeneic de terceros APC o en vivo la transferencia adoptiva de prevencion las células en los receptores injertados con un corazón de terceros permiten análisis de la especificidad de los donante. Considerando que el método en vivo requiere un número considerable de células, poco representado las subpoblaciones de células pueden evaluarse más fácilmente actividad supresora en vitro³³.

Respuesta humoral también puede ser medido para evaluar el estado de la tolerancia y el control de las respuestas de anticuerpos dirigidos a los antígenos del donante. De hecho, la tolerancia se caracteriza por la ausencia de la respuesta humoral hacia el donante sino la conservación de la capacidad de los beneficiarios a desarrollar la respuesta humoral a antígenos nuevos y preservación de las respuestas de memoria. En primer lugar, el principio de la detección del aloanticuerpo se basa en el reconocimiento de las células del donante por receptores anticuerpos tras incubación del tipo de la célula donante con el suero del receptor injertado. Segunda respuestas humorales a antígenos exógenos pueden ser evaluados después del estímulo de receptores tolerantes a largo plazo con hemocianina de Lapa de ojo de la cerradura (KLH) emulsionado con completa adyuvante de Freund de. La presencia de anticuerpos IgM e IgG específicos contra los antígenos puede detectarse los días 4 y 13, respectivamente, después de la inmunización, con ensayo de inmunosorbente vinculado enzima (ELISA)³⁴. En tercer lugar, la preservación de la respuesta inmune de memoria puede ser evaluada por la inyección de xenogeneicos de glóbulos rojos (gr) a -7 y + 3 días del trasplante y la tinción con destinatario suero de recolectadas en días + 8 y + 17 después del trasplante de glóbulos rojos. Todos estos métodos permiten la identificación de subtipos de inmunoglobulinas mediante anticuerpos específicos de la secundarios y adquisición rápida de los resultados en menos de 1,5 h por la FACS coloración o unas horas por ELISA.

Finalmente, estos protocolos están diseñados para la caracterización de los modelos de trasplante y pueden ser, en cierta medida, aplicada a los modelos de enfermedad autoinmune. Los principios del método pueden transponerse a todas las especies.