ネッタイシマカジカのベクトルで脂肪ボディ臓器培養システム

1 ですソリューションと試薬の準備 アミノ酸原液 準備 4 X アミノ酸原液 23 , 24 の重さによって、。表 1 の濃度によると三角フラスコに 20 種類のアミノ酸を追加します 。 注: いくつかのケースで amino acid(s) ソリューションから除外でき等しい浸透圧物質濃度を維持するためにマンニトールのモル同量に置き換えられます。 DdH 2 O ソリューションの適切なボリュームを生成するための適切な量を追加します。 アミノ酸が完全に溶解していることは、確実に 熱液体が完全にクリアされるまで継続的に攪拌しながら優しく; わずかな黄色の色合いにかかります 。 注: 解散するより疎水性アミノ酸のいくつかを許可するように塩酸を追加することによって pH を 6 に削減が必要になる場合があります。 ソリューションの約数と滅菌フィルター シリンジ フィルターを用いた 0.2 μ m 孔サイズ。 -20 ° C まで 6 ヶ月間で密封された容器でストア。 AP 注: 25 を参照してください。 20 X の原液を塩、水 50 mL で 表 2 に示す塩を組み合わせます。完全に溶解するまで攪拌します 。 注: 少し熱塩を完全に解消するソリューションが必要になる場合があります。 無菌フィルター シリンジ フィルターを用いた 0.2 μ m 孔サイズと-20 で 50 mL のチューブで、ソリューションを格納 ° C カルシウム原液 カルシウム原液 X 50、100 mL の水 (表 3) に塩化カルシウムの 0.90 g を追加; 完全に溶解するまで攪拌します。 注射器を用いた無菌フィルター 50 mL チューブに分注 0.2 μ m の細孔径を持つソリューションをフィルターや-20 デパート ° C Tris バッファー (pH 7.4) 、トリス バッファー、塩と 表 4 のソリューションを組み合わせて、ddH 2 O を追加 100 mL. 注射器を用いた無菌フィルター フィルター 0.2 μ m の気孔のサイズそして因数のソリューション 50 mL チューブに; 常温で保存します。 脂肪体培 脂肪体の培養培地を準備する上記のすべてのソリューションを準備します。 表 5 脂肪体培地 200 mL にボリュームに従ってそれらを結合します。 7.2 水酸化ナトリウムや塩酸を使用して pH を調整します。 無菌フィルター シリンジ フィルターを用いた 0.2 μ m 孔サイズ ソリューションです。 15 ml にソリューションを分割し、-20 ° C で 6 ヶ月保存します。 2。郭清の準備 照明顕微鏡 (10-20 倍の倍率) を準備し、2 つの極細ピンセットと顕微解剖はさみのペアを置く。 は、実験に必要なすべてのソリューションを準備します。部屋の温度に脂肪体培養液を解凍 。 注: 沈殿は優しくない 30 以上にソリューションを加熱することによって解散することができます ° C ヒメアリ、雌成虫蚊 (出現後 3-7 日) を収集し、それらの麻酔二酸化炭素または氷を使用して 注: 一度麻酔、蚊べき CO 2 の下で最短の時間で可能であれば、代わりに 20 分を超えない、蚊が氷の上に麻酔され約 30 分の 3 ml の APS の井戸あたり 6 ウェル プレートを準備します。 3。脂肪体解剖 解剖顕微鏡の焦点を当てるし、快適な高さに椅子を合わせる。 顕微鏡表面に凹顕微鏡スライドを配置し、中心に AP の 2 滴を追加します。 、鉗子を使用して足を蚊をピックアップし、顕微鏡スライドの APS の表面にそれを転送します。 慎重に左の手でピンセットで胸郭によって蚊をグリップし、腹側、上向きに蚊を回転します。 胸郭によって安定した体を保持している間、右手の鉗子で最後の 2 つの腹部のセグメントをつかみ、注意深く引き出します 。 注: 最後の 2 つの腹部のセグメント腹部からと添付の卵巣、キイロショウジョウバエマルピギー細管、後腸、中腸; 分離されます。時々、作物は、腹部からスライドされます。彼らが削除されていない場合作成された小さな穴に鉗子の閉鎖のヒントを挿入し、残りの組織を削除します。 は、右の鉗子を脇、春はさみを拾います。胸部下のセグメントまでの腹部の穴に 1 つのブレードをスライドさせます。優しくかつ腹部に縦にカットします 。 注: カットがなされたら、腹部だすべき外側に展開、これはすぐに発生可能性があります。 横カットは、胸郭の下や最初のカットが終了した位置より少し下になります 2 番目のカットをすることを続行します 。 注: 腹部必要があります開くし、キューティクルと AP 内側浸漬脂肪体、胸部から切り離して考えます。、この腹部の体壁は 生体外で 文化のための脂肪体準備します。 は組の鉗子の先端を使用して、APS ソリューションから脂肪体を持ち上げ、ソリューションから室温で AP を含む 6 ウェル プレートに転送。脂肪体文化に進む前に約 0.5 時間の残りの部分にティッシュを許可します。 4。脂肪体文化 それらを平衡に少なくとも 0.5 h の室温での AP の脂肪体をインキュベートします。 は、鉗子の先端を使用して脂肪体を転送し、優しくそれらを APS ソリューション持ち上げます。脂肪体培地に先端を下げる 。 注: 脂肪体に媒体の表面上を開き、自由に浮かぶ。脂肪体の文化は、通常、各ウェル中の 150-200 μ L での 96 ウェル プレートで行います。1 つも、3 つまでの個々 の脂肪体を合うことができるし、彼らが 12 時間以上 (未発表の個人的な結果) の実行が可能です。 潜伏期間後脂肪体を培地からダウン ストリーム処理のための適切な試薬を含む 1.5 mL 遠心チューブに転送します 。 注: 典型的な分析を含む qPCR 16 , 17 , 18 , 19, ウエスタンブロット 18 ,メタボロミクス 22 21、プロテオミクスやトランスクリプトミクス 26 20。