JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

Жир тела орган культуры системы в Aedes Aegypti, вектор вируса Зика

Published: August 19, 2017
doi:
10.3791/55508
, , , , , , , ,
1Department of Biology,New Mexico State University, 2Department of Molecular Genetics and Microbiology,Duke University, 3Department of Computer Sciences,New Mexico State University, 4Department of Epidemiology of Microbial Diseases,Yale School of Public Health, 5Institute of Applied Biosciences,New Mexico State University

Summary

Жир тела является центральным органом метаболизма в насекомых. Мы представляем системы культуры живой орган, который позволяет пользователю для изучения реакции изолированных жира тела ткани на различные стимулы.

Abstract

Насекомых жира тела играет центральную роль в метаболизме насекомых и запаса питательных веществ, зеркального отображения функций печени и жировой ткани в позвоночных. Насекомых жира тела ткани обычно распространяется по всему телу насекомых. Однако это часто сконцентрированы в животе и придает брюшной стенки тела.

Москито тела жира является единственным источником желток белков, которые имеют решающее значение для производства яиц. Таким образом, в пробирке культуры тканей тела жира комаров представляет собой важную систему для изучения физиологии комаров, метаболизма и, в конечном счете, производство яиц. Жир тела культуры процесс начинается с подготовки растворов и реагентов, включая аминокислоты акций решения, Aedes физиологического раствора соляной раствор (APS), раствор кальция и тела жир питательной среды. Этот процесс продолжается с вскрытия жира тела, следуют экспериментальное лечение. После лечения может выполняться целый ряд различных анализов, включая РНК последовательности (РНК-Seq), ПЦР, западной помарки, протеомики и метаболомики.

В нашем примере эксперимента мы демонстрируем протокола посредством обрезания и культуры органов жира от желтой лихорадки комаров, Aedes aegypti, основной вектор арбовирусов, включая денге и чикунгунья Зика. RNA от жира тела, культивированный условиях физиологические известный upregulate желток белки против управления были предметом анализа РНК-Seq продемонстрировать потенциальную полезность этой процедуры для расследования экспрессии генов.

Introduction

Комары являются векторами разрушительных болезней человека, включая малярия, лихорадка денге, чикунгуньи и Зика1,2,3. Несмотря на интенсивные международные усилия по сдерживанию этих заболеваний и контролировать болезнь передающих популяций комаров эпидемий болезней, переносимых комарами по-прежнему распространены, особенно в развивающихся странах. Эффективных вакцин против многих из этих заболеваний, либо недоступны, либо ограниченной эффективности4,5. Наиболее эффективным способом предотвратить вспышки является контроль популяций комаров, главным образом за счет использования инсектицидов лечения. Однако инсектицидам разработал среди многих популяций комаров и стать общей проблемой во всем мире6,,78. Изучение физиологии комаров имеет важное значение для разработки новых инструментов и стратегий для борьбы с болезнью.

Москито тела жир играет центральную роль в запаса питательных веществ и метаболические гомеостаза, размножение, ксенобиотиков катаболизма9,10,,1112. Это основные хранения орган для триглицеридов, гликоген и аминокислоты в форме хранения белков. Он также функционирует как расположение синтеза для большинства гемолимфа белков и метаболитов. В комаров жир тела является единственным источником производства белок желток, который возникает у женщин после того, как они принимают крови еды13,14.

Тип основной ячейки жир тела является большой, полиплоидных trophocyte или Адипоцит3,9,10,12. Жир тела ткани организована в долях или Шубы и можно найти во всех частях тела комаров, самая большая часть находится в животе, где большой долей жира тела прикреплены к брюшной стенки тела.

Система культуры жира тела комаров, представленные здесь была разработана в 70-х и остается мощным инструментом для изучения жира тела физиологии10, особенно в сочетании с текущей технологии анализа. Фонд этот метод основан на изоляции брюшной стенки тела и тканей связанных жира тела. Гидрофобная природа брюшной кутикулы вызывает его плавать на поверхности питательной среды, с прилагаемой лопастями брюшной жир тела погружен. Поддерживаются дыхальца и tracheolar структуры, обеспечение оксигенации культурной ткани. Отныне мы будет называть эти препараты «жир тела.» Изолированные жира тела остаются жизнеспособными в течение более чем 12 h когда инкубировали в соответствующей среде (неопубликованные результаты). Культура тела жира является ценным инструментом, который рассматривает целый ряд вопросов относительно жира тела эндокринологии и физиологии9,10,12,,1516, 17.

Искусственный жир тела могут быть подвергнуты различные экспериментальные и контроля лечения, сроки которого могут приниматься следователем. В конце инкубационного периода жир тела может собираться и обрабатываться по течению анализов, в том числе ПЦР16,,1718,19, западной blotting18 ,20, протеомики21или22метаболомики. Эксперименты могут выполняться на разных масштабах – от отдельных органов жира для групп из сотен, которые могут быть культивировали вместе.

Представитель результаты здесь были получены от органов жира, культивируемых в присутствии аминокислоты и 20-гидрокси экдистероидов стероидных гормонов для имитации крови еды активации vitellogenesis16,17, 23,24. Мы проанализировали и сравнили дифференциального ген выражение не активирована по сравнению с активированной жира тела через анализ секвенирование нового поколения.

Protocol

1. подготовки решений и реагентов аминокислота Стоковый раствор 23 , с амино кислоты раствор подготовить 4 X 24 путем взвешивания и Добавление 20 различных аминокислот в колбу Эрленмейера согласно концентрации, приведенные в таблице 1. Примечание: В некоторых случаях, amino acid(s) могут быть исключены из решения и заменены Молярная равное количество маннитол поддерживать равной концентрации osmolytes. Добавить соответствующее количество ddH 2 O производить желаемого объема раствора. Для обеспечения что аминокислоты полностью не растворится, тепло мягко постоянно помешивая, до тех пор, пока жидкость совершенно ясно; это займет на небольшой желтый оттенок. Примечание: Это может быть необходимо снизить рН 6 путем добавления HCl разрешить некоторые из гидрофобных аминокислот распустить. Размер пор Алиготе решение и стерильные фильтр с помощью фильтра шприц с 0,2 мкм. Хранят в плотно закрытой таре при температуре-20 ° C до 6 месяцев. APS Примечание: 25 см. Для 20 X солевая Стоковый раствор, объединить солей, перечисленные в таблице 2 в 50 мл воды. Размешайте до полного растворения. Примечание: Это может быть необходимо слегка нагреть раствор до полного растворения соли. Стерильными фильтр с помощью фильтра шприц с 0,2 мкм, размер пор и хранить решение в 50-мл пробирку в -20 ° с. Кальция раствор для 50 X Стоковый раствор кальция, добавить 100 мл воды (Таблица 3) 0,90 г, кальция хлорида; размешайте до полного растворения. Стерильными фильтр, с помощью шприца фильтр с размером пор 0,2 мкм, аликвота решение в 50-мл пробирки и хранить при -20 ° с. Буфер Tris (рН 7,4) Tris буфера, смешать соль и решения, перечисленные в таблице 4 и добавить ddH 2 O до 100 мл. Стерильными фильтр, с помощью шприца фильтр с размером пор 0,2 мкм и Алиготе решение в 50-мл пробирок; хранить при комнатной температуре. Жир тела культуры среднего подготовить тело жир питательной среды, подготовить все решения, перечисленные выше. Объединить их согласно томов в таблице 5 сделать 200 мл питательной среды жира тела. Скорректировать рН 7,2 с использованием NaOH или HCl. Стерильными фильтр решения с помощью шприца фильтр с размером пор 0,2 мкм. Решение разделить 15 мл аликвоты и хранить при температуре от-20 ° C до 6 месяцев. 2. Подготовка для вскрытия подготовить стереомикроскопом (10-20 кратном) с подсветкой и выложить два ультра-тонкой пинцета и микро Рассечение ножницами. Подготовка всех решений, необходимых для проведения эксперимента. Растопить жир тела питательной среды до комнатной температуры. Примечание: Выделений может быть расторгнут нежно Отопление решение не выше 30 ° с. С аспиратором, собирать взрослых женщин комаров (3-7 дней после появления) и анестезировать их с помощью углекислого газа или ice. Примечание: После наркоза, комаров должны находиться под CO 2 на короткое время можно, не превышающей 20 мин в качестве альтернативы, комаров может быть под наркозом на льду и продержали около 30 мин 6-ну плита с 3 мл APS на хорошо подготовить. 3. Вскрытия жира тела фокус рассечения стереомикроскопом и отрегулировать стул на удобной высоте. Место вогнутой микроскопа на поверхности микроскоп и добавить две капли APS в центр. Подобрать комаров в ногу с помощью щипцов и перенести его на поверхности APS на слайде Микроскоп. Тщательно сцепление комаров грудной клетки, с щипцами в левой руке и вращать комаров, так что вентральной стороне вверх. При удерживании тела устойчивый, грудной клетки, возьмите две последние сегменты, с щипцами в правой руке и осторожно потяните. Примечание: Две последние сегменты отделится от живота и прилагаемый яичников, Malpighian трубочки, кишку и средняя; Иногда урожай будет выскользнуть из живота. Если они не были удалены, вставьте маленькое отверстие создано закрытое советы щипцы и удалите оставшиеся тканей. Выделить право щипцами и забрать весной ножницы. Слайд 1 лезвие в отверстие в животе до этапа ниже грудной клетки. Быстро и аккуратно разрезать вдоль живота. Примечание: После разреза живота следует начать расширять наружу, хотя это не может произойти сразу. Перейти к сделать второй отрезок, который будет боковой разрез ниже грудной клетки и чуть ниже где закончился первый разрез. Примечание: Живот должен затем открыть и отмежеваться от грудной клетки, с кутикулы вверх и жир органы стороны погружен в APS. Это брюшной стенки тела является подготовка тела жира в vitro культуры. Снять жир тела от APS решения, используя кончик пару щипцов и перевести их из раствора на пластину 6-а, содержащий APS при комнатной температуре. Разрешить ткани для отдыха около 0,5 ч до продвижения к культуре тела жира. 4. Культура тела жира инкубировать жир тела на APS при комнатной температуре по крайней мере 0,5 ч сбалансировать их. Передача жир тела, используя кончик щипцы и осторожно выньте их из раствора APS. Опустите кончик в жир тела культуры среднего. Примечание: Жир тела следует открыть на поверхности носителя и свободно плавать. Культура тела жира обычно выполняется в 96-луночных пластин, с 150-200 мкл среды в каждой скважине. Также можно разместить до трех отдельных органов жира, и они являются жизнеспособными для более чем 12 h (неопубликованные личные результаты). После инкубационного периода, передача тела жира от среднего в 1,5 мл пробирок, содержащие соответствующие реагенты для последующей обработки. Примечание: Типичный анализы включают ПЦР 16 , , 17 18 , 19, западной blotting 18 , 20, transcriptomics 26, протеомики 21 или 22 метаболомики.

Representative Results

В качестве примера мы выступали эксперимент культуры жир тела и изолированных жир тела, стимулируется инкубации их на раствор, содержащий сбалансированную смесь всех двадцати естественным аминокислот и насекомых стероидных гормонов 20-гидрокси экдистероидов (10 мкм) для 6 h . Как элемент управления жир тела были инкубировали на APS на равное количество времени. После инкубации общая РНК был изолирован с помощью tri реагент27 следуя инструкциям производителя. Качество и количество извлечения образцов РНК были оценены с помощью спектрофотометра, флуориметрический количественный и электрофорез геля агарозы. РНК последовательности библиотеки были созданы с помощью 4 мкг всего РНК и были количественно с помощью двух разных методов. Впоследствии библиотеки были разосланы коммерческого поставщика услуг для парных конец последовательности. Результаты этого эксперимента приведены в таблице 6. Гены, показаны сильнейших транскрипционный анализ реакции на аминокислоты и 20-hydroxyecdysone были главным образом желтка белок генов, которые согласна с предыдущим результаты11. Рисунок 1 показывает, что тепла карта с указанием уровни выражения гена 1 256 дифференциально выразил гены от искусственный жир тела после двух различных методов лечения. Рисунок 1 . Тепловая карта генов, выраженные в культуре тела жира. Тепловая карта была рассчитана на основе количество конкретных протоколов для каждого гена в различных библиотеках, используя пакет heatmap28 , которая является частью среды программного обеспечения R. Темный оттенок представляет выше экспрессии генов. 1256 генов с статистически значимые различия в выражении (Q-значения < 0,05) отображаются. Гены упорядочиваются согласно их усредненные выражение уровня, обозначается дендрограмма слева (не по их Филогенетические отношения). Обратите внимание на высокое количество генов с вверх или вниз регулируемой выражение после стимуляции с аминокислоты (AA) и 20-hydroxyecdysone (20E). APS = Aedes физиологического раствора. Просмотреть Дополнительные файл 1 список генов и их относительное выражение уровня. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Амино кислоты Молекулярный вес г/моль Мм концентрации мг / литр mg на объем 300 мл Аланинаминотрансфераза 89.1 26,68 2377.19 713.16 Аргинин 174.2 26,68 4647.66 1394.3 Аспарагин 150.1 26,68 4004.67 1201.4 Аспарагиновая кислота 133 26,68 3548.44 1064.53 Цистеин 121.16 10,68 1293.99 388,2 Глутаминовая кислота 147.1 26,68 3924.63 1177.39 Глютамин 146 26,68 3895.28 1168.58 Глицин 75 53.32 3999 1199.7 Гистидин 155,16 80 12412.8 3723.84 Изолейцин 131 10,68 1399.08 419.72 Лизина 183 26,68 4882.44 1464.73 Лейцина 131 26,68 3495.08 1048.52 Фенилаланин 165 10,68 1762.2 528.66 “ПроЛайн” 115 26,68 3068.2 920.46 Серина 105 53.32 5598.6 1679.58 Треонин 119 10,68 1270.92 381.28 Триптофан 204 10,68 2178.72 653,62 Тирозин 181 5.32 962.92 288.88 Валин 117 10,68 1249.56 374.87 Метионин 149 10,68 1591.32 477.4 Таблица 1. 4 x амино кислоты раствор. Компонент Вес в граммах, добавить 50 мл ddH2O NaCl 8,0 г KCl 0,074 g MgCl2-6 H2O 0,120 g NaHCO3 0.0250 g Таблица 2. 20 X соль Стоковый раствор. Компонент Вес в граммах, добавить 100 мл ddH2O CaCl2-2 H2O 0.90 g g > таблицы 3. 50 x Стоковый раствор кальция. Компонент Концентрация раствора запасов Объем запасов для буфера 100 мл Tris pH8.0 1 M 5 мл ЭДТА 0,25 М 2 мл NaCl NA 0,3 г ddH2O NA до 100 мл (~ 93 мл) Таблица 4. Буфер Tris. Компонент Объем запасов для 200 мл Стоковый раствор аминокислот 150 мл Соляной раствор 10 мл Стоковый раствор кальция 4 мл TES буфер 10 мл ddH2O 26 мл Таблица 5. Жир тела питательной среды. Аннотация Гена описание Сбросить изменения P-значение AAEL006138 Вителлогенина B 3443 2.52E-112 AAEL006126 Вителлогенина C 2795 8.64E-91 AAEL006563 vitellogenic Карбоксипептидаза 1002 2.17E-119 AAEL010434 Вителлогенина A 220 1.14E-27 AAEL006542 vitellogenic Карбоксипептидаза 185 2.14E-65 AAEL012678 AAEL003006-PA [Aedes aegypti](65%) 96 4.00E-70 AAEL000080 Гипотетические белка 82 6.69E-188 AAEL015312 Vitellogenic катепсин B 77 1.27E-15 AAEL009588 ядерные рецептор 3 75 4.58E-56 AAEL010529 Гипотетические белка 66 1.32E-29 Таблица 6. Экспериментальные результаты. Дополнительный файл 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Насекомых органной культуры широко использовался для изучения насекомых эндокринологии, развития и обмена веществ, а также изучить взаимодействие между конкретных органов и бактериальных симбионтами29,,3031, 32,,33–34. В vitro жира тела органной культуры был использован специально для изучения аминокислоты транспорта и регулирования производства белок желток комаров и других двукрылыхпо16,17,35 , 36. в процессе vitellogenesis, жир тела комара использует массив амино кислоты высокой специфичности транспортеров для импорта крови еды Производные аминокислот из гемолимфа синтезировать большое количество желток белки12 ,19,35,36. Культура тела жира сыграл разграничения потребностей в питании жир тела в этом контексте18.

Качество исходного материала, женский комаров, имеет решающее значение для успеха этих экспериментов. Личинки комаров поднял в переполненном под условия и кормили на высокой питательной диеты обычно производят лучшие результаты. Есть некоторые важные переменные следует учитывать при создании условий культуры жира тела комаров в лабораторных условиях с точки зрения экспериментальный дизайн. Мы показали в предыдущих исследованиях, которые экспрессии генов жира тела значительно варьируется в зависимости от индивидуальной истории жизни и состояния питания комаров11,22. Комаров культуры условия должны быть единообразными для уменьшения колебаний в размере и пищевые запасы экспериментальной комаров. Кроме того персонала, выполняющего вскрытия должны быть обучены для обеспечения быстрого и точного вскрытия с последовательные результаты. Жизнеспособность клеток в изолированных органах жира может быть проверена с помощью различных пятная методы37,38.

Экспериментальный дизайн эксперимента культура тела жира следует принимать во внимание количество вскрытия в определенный период времени. Когда требуются большие количества жира тела, может потребоваться несколько сеансов рассечение или несколько Диссекторы. Существует широкий спектр будущих приложений для в vitro культура тела жира в комаров и других насекомых. Это будет особенно полезен для тестирования потенциальных наркотиков кандидатов для насекомыми. Использование методов трансгенных насекомых для выражения конкретных репортер белков в жир тела trophocytes откроет новые методы для разработки мощных bioassays для изучения физиологии жира тела.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано NIH Грант #SC1AI109055, 2014 NMSU HHMI Грант #52008103 и NSF PGR Грант #1238731. Мы благодарим участников NMSU весной 2015 BIOL302 молекулярной методы класса и Lavesh Bhatia за их техническую поддержку с экспериментов культуры жира тела.

Materials

Scissors  Fiskars 83872
Fly pad Genesee Scientific 789060
Battery-powered aspirator w/ collection vial Hausherrs Machine Works, Inc. 3740-01-210-2368
Fine tip forceps World Precision Instruments, Inc.  500085
Light microscope  Leica Microsystems
96 well plate  Sigma CL S3383
Sucrose Sigma S9378
Alanine Sigma A7627
Arginine Sigma A5006
Asparagine Sigma A0884
Aspartic Acid Sigma A9256
Cysteine Sigma W326305
Glutamic Acid Sigma G1251
Glutamine Sigma G3126
Glycine Sigma G2879
Histidine Sigma H6034
Isoleucine Sigma I2752
Lysine Sigma L5501
Leucine Sigma L8000
Phenylalanine Sigma P2126
Proline Sigma P0380
Serine Sigma S4500
Threonine Sigma T8625
Tryptophan Sigma T0254
Tyrosine Sigma T3754
Valine Sigma V0500
Methionine Sigma M9625
NaCl Sigma S7653
KCl Sigma P9333
MgCl2-6H2O Sigma M2670
NaHCO3 Sigma S5761
CaCl2-2H2O Sigma C8106
Tris pH8.0  Sigma T1503
EDTA Sigma E6758
ddH2O Sigma W4502
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benelli, G., Mehlhorn, H. Declining malaria, rising of dengue and Zika virus: insights for mosquito vector control. Parasitol Res. 115 (5), 1747-1754 (2016).
  2. Newby, G., et al. The path to eradication: a progress report on the malaria-eliminating countries. Lancet. 387 (10029), 1775-1784 (2016).
  3. Clements, A. N. . The Biology of Mosquitoes. 2, (1992).
  4. Long, C. A., Zavala, F. Malaria vaccines and human immune responses. Curr Opin Microbiol. 32, 96-102 (2016).
  5. Mendis, K. N., David, P. H., Carter, R. Human immune responses against sexual stages of malaria parasites: considerations for malaria vaccines. Int J Parasitol. 20 (4), 497-502 (1990).
  6. Frings, S., Lindemann, B. Odorant response of isolated olfactory receptor cells is blocked by amiloride. J Membr Biol. 105 (3), 233-243 (1988).
  7. Froese, A., Szyszka, P., Menzel, R. Effect of GABAergic inhibition on odorant concentration coding in mushroom body intrinsic neurons of the honeybee. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 183-195 (2014).
  8. Yewhalaw, D., et al. Multiple insecticide resistance: an impediment to insecticide-based malaria vector control program. PLoS One. 6 (1), e16066 (2011).
  9. Arrese, E. L., Soulages, J. L. Insect fat body: energy, metabolism, and regulation. Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2010).
  10. Raikhel, A. S., Deitsch, K. W., Sappington, T. W., Crampton, J. M., Beard, C. B., Louis, C. . The Molecular Biology of Insect Disease Vectors: A Methods Manual. , 507-522 (1997).
  11. Price, D. P., et al. The fat body transcriptomes of the yellow fever mosquito Aedes aegypti, pre- and post- blood meal. PLoS One. 6 (7), e22573 (2011).
  12. Hansen, I. A., Attardo, G. M., Rodriguez, S. D., Drake, L. L. Four-way regulation of mosquito yolk protein precursor genes by juvenile hormone-, ecdysone-, nutrient-, and insulin-like peptide signaling pathways. Front Physiol. 5, 103 (2014).
  13. Raikhel, A. S., Dhadialla, T. S. Accumulation of yolk proteins in insect oocytes. Annu Rev Entomol. 37, 217-251 (1992).
  14. Raikhel, A. S., et al. Molecular biology of mosquito vitellogenesis: from basic studies to genetic engineering of antipathogen immunity. Insect Biochem Mol Biol. 32 (10), 1275-1286 (2002).
  15. Hansen, I. A., Attardo, G. M., Chandrasekar, R. Ch. 6. Short Views on Insect Molecular Biology. , (2009).
  16. Hansen, I. A., Attardo, G. M., Park, J. H., Peng, Q., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-mediated amino acid signaling in mosquito anautogeny. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (29), 10626-10631 (2004).
  17. Hansen, I. A., Attardo, G. M., Roy, S. G., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-dependent activation of S6 kinase is a central step in the transduction of nutritional signals during egg development in a mosquito. J Biol Chem. 280 (21), 20565-20572 (2005).
  18. Attardo, G. M., Hansen, I. A., Shiao, S. H., Raikhel, A. S. Identification of two cationic amino acid transporters required for nutritional signaling during mosquito reproduction. J Exp Biol. 209 (Pt 16), 3071-3078 (2006).
  19. Carpenter, V. K., et al. SLC7 amino acid transporters of the yellow fever mosquito Aedes aegypti and their role in fat body TOR signaling and reproduction. J Insect Physiol. 58 (4), 513-522 (2012).
  20. Attardo, G. M., Higgs, S., Klingler, K. A., Vanlandingham, D. L., Raikhel, A. S. RNA interference-mediated knockdown of a GATA factor reveals a link to anautogeny in the mosquito Aedes aegypti. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (23), 13374-13379 (2003).
  21. Hugo, L. E., et al. Proteomic biomarkers for ageing the mosquito Aedes aegypti to determine risk of pathogen transmission. PLoS One. 8 (3), e58656 (2013).
  22. Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti. Parasit Vectors. 8, 252 (2015).
  23. Uchida, K., et al. Induction of oogenesis in mosquitoes (Diptera: Culicidae) by infusion of the hemocoel with amino acids. J Med Entomol. 38 (4), 572-575 (2001).
  24. Uchida, K., Ohmori, D., Yamakura, F., Suzuki, K. Changes in free amino acid concentration in the hemolymph of the female Culex pipiens pallens (Diptera: Culicidae), after a blood meal. J Med Entomol. 27 (3), 302-308 (1990).
  25. Hayes, E. Determination of a physiological saline solution for Aedes aegypti .(L). J Econ Entomol. 46 (4), 624-627 (1953).
  26. Price, D. P., et al. The Fat Body Transcriptomes of the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti, Pre- and Post Blood Meal. Plos One. 6 (7), e22573 (2011).
  27. Chomczynski, P., Mackey, K. Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide-and proteoglycan-rich sources. Biotechniques. 19 (6), 942-945 (1995).
  28. Fujiwara, T., Kazawa, T., Haupt, S. S., Kanzaki, R. Postsynaptic odorant concentration dependent inhibition controls temporal properties of spike responses of projection neurons in the moth antennal lobe. PLoS One. 9 (2), e89132 (2014).
  29. Larsen, W. P. Growth in an insect organ culture. J Insect Physiol. 13 (4), 613-619 (1967).
  30. Judy, K. J., et al. Isolation, Structure, and Absolute Configuration of a New Natural Insect Juvenile Hormone from Manduca sexta. Proc Natl Acad Sci USA. 70 (5), 1509-1513 (1973).
  31. Marks, E. P. The action of hormones in insect cell and organ cultures. Gen Comp Endocrinol. 15 (2), 289-302 (1970).
  32. Hughes, G. L., Pike, A. D., Xue, P., Rasgon, J. L. Invasion of Wolbachia into Anopheles and Other Insect Germlines in an Ex vivo Organ Culture System. PLoS One. 7 (4), e36277 (2012).
  33. Postlethwait, J. H., Handler, A. M. Roles of Juvenile-Hormone and 20-Hydroxy-Ecdysone during Vitellogenesis in Isolated Abdomens of Drosophila melanogaster. J Insect Physiol. 25 (5), 455-460 (1979).
  34. Spielman, A., Gwadz, R. W., Anderson, W. A. Ecdysone-initiated ovarian development in mosquitoes. J Insect Physiol. 17 (10), 1807-1814 (1971).
  35. Boudko, D. Y., et al. Substrate specificity and transport mechanism of amino-acid transceptor Slimfast from Aedes aegypti. Nat Commun. 6, 8546 (2015).
  36. Fleischer, J., Bumbalo, R., Bautze, V., Strotmann, J., Breer, H. Expression of odorant receptor Olfr78 in enteroendocrine cells of the colon. Cell Tissue Res. 361 (3), 697-710 (2015).
  37. Jones, K. H., Senft, J. A. An improved method to determine cell viability by simultaneous staining with fluorescein diacetate-propidium iodide. J Histochem Cytochem. 33 (1), 77-79 (1985).
  38. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. A3B, (2001).

Tags

Fat BodyOrgan CultureAedes AegyptiVectorZika VirusMosquito PhysiologyYolk Protein ProductionNutrient UptakeIn VitroNext-generation SequencingEcdysoneAmino AcidPhysiological SalineDissection

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Chung, H., Rodriguez, S. D., Carpenter, V. K., Vulcan, J., Bailey, C. D., Nageswara-Rao, M., Li, Y., Attardo, G. M., Hansen, I. A. Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus. J. Vis. Exp. (126), e55508, doi:10.3791/55508 (2017).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image