지방 기관 문화 시스템 Aedes Aegypti, Zika 바이러스 벡터에

1. 솔루션 및 시 약 준비 아미노산 재고 솔루션 준비 4 X 아미노산 재고 솔루션 23 , 24 무게와 표 1에 주어진 농도 따라 삼각 플라스 크에 20 다른 아미노산을 추가. 참고: 경우에 따라 amino acid(s) 솔루션에서 제외 하 고 수 어 금 니 같은 양의 osmolytes의 동등한 농도 유지 하기 위해 마 니 톨에 의해 대체. DdH 2 O 생산 솔루션의 원하는 볼륨의 적절 한 금액을 추가. 아미노산 완전히 해산 할 수 있도록 부드럽게 액체 완전히 취소 될 때까지 지속적으로 교 반 하면서가 열, 그것은 약간의 노란 색상에 걸릴 것입니다. 참고: 그것은 해산 더 소수 성 아미노산의 일부 있도록 HCl를 추가 하 여 6 pH를 감소 해야 할 수도 있습니다. 약 수는 솔루션 및 살 균 필터 주사기 필터를 사용 하 여 0.2 µ m로 기 공 크기. 최대 6 개월 동안-20 ° C에서 밀봉된 한 콘테이너에서 매장. APS 참고: 25 참조. X 20에 대 한 재고 솔루션을 소금, 물 50 mL에 표 2에 나열 된 염 결합. 완전히 녹아 때까지 저 어. 참고: 그것은 약간을 완전히 해산 소금 솔루션을 열 필요가 있을 수 있습니다. 멸 균 필터 주사기 필터를 사용 하 여 0.2 µ m로 기 공 크기 및 솔루션-20에서 50 mL 튜브에 저장 ° c. 칼슘 재고 솔루션 칼슘 재고 솔루션 X 50 물 (표 3) 100 mL를 염화 칼슘의 0.90 g 추가; 완전히 녹아 때까지 저 어. 멸 균 필터 주사기를 사용 하 여 0.2 µ m 기 공 크기, aliquot 솔루션 50 mL 튜브, 필터링 및-20에서 저장 ° c. Tris 버퍼 (pH 7.4) 는 Tris 버퍼, 소금 및 표 4에 나열 된 솔루션을 결합 하 여 고 추가 ddH 2 O 최대 100 mL. 멸 균 필터 주사기를 사용 하 여 0.2 µ m 기 공 크기와 약 수 솔루션 50 mL 튜브 필터, 실내 온도에 저장. 뚱뚱한 몸 문화 매체 뚱뚱한 몸 문화 매체를 준비 하려면 위에 나열 된 모든 솔루션을 준비. 뚱뚱한 몸 문화 매체의 200 mL을 표 5에서 볼륨에 의하여 그들을 결합 하는 것. 7.2 NaOH 또는 HCl에 산도 조정. 멸 균 필터 주사기 필터를 사용 하 여 0.2 µ m 기 공 크기와 솔루션. 15 mL aliquots로 솔루션을 분할 하 고-20 ° C에서 최대 6 개월까지 저장. 2. 해 부에 대 한 준비 조명 stereomicroscope (10-20 배 확대)을 준비 하 고 2 초 정밀 핀셋과 마이크로 해 부가 위 레이아웃. 실험에 필요한 모든 솔루션을 준비합니다. 실내 온도에 뚱뚱한 몸을 배양 해 동. 참고: 침 부드럽게 30 보다 더 높은 솔루션을가 열 하 여 녹 수 있다 ° c. 는 흡 인기와 성인 여성 모기 (출현 후 3-7 일)를 수집 하 고 그들을 anesthetize 이산화탄소 또는 얼음을 사용 하 여 참고: 한 번 취, 모기 지켜져야 한다 CO 2 짧은 시간에 대 한 가능한, 또는 20 분을 초과 하지 않는, 모기 얼음에 취 수 하 고 약 30 분 동안 보관 잘 당 ap 3 mL와 함께 6-잘 접시 준비. 3. 뚱뚱한 몸을 해 부 해 stereomicroscope을 집중 하 고 편안한 높이로 자를 조정. 현미경 표면에 오목 현미경 슬라이드를 놓고 중앙에 APS의 두 방울을 추가. 모기 다리는 집게를 사용 하 여 선택 하 고 현미경 슬라이드에 APS 표면에 그것을 전송. 신중 하 게 모기는 흉부에 의해 왼쪽 손에 집게 그립 하 고 복 부 쪽이 위쪽으로 모기 회전. 시체 꾸준한 흉부를 잡고 있는 동안, 오른손에 집게와 마지막 2 개의 복 부 세그먼트를 파악 하 고 부드럽게 당겨. 참고: 마지막 2 개의 복 부 세그먼트에서 복 부와 연결 된 난소, 말 tubules, hindgut, midgut; 구분 됩니다. 때로는 자르기 복 부 밖으로 슬라이드 합니다. 그들은 제거 되지 않은, 만든 작은 구멍에는 집게의 닫힌된 끝을 삽입 하 고 나머지 조직 제거. 오른쪽 집게를 따로 설정 하 고 봄이 위를 선택 합니다. 가슴 아래 세그먼트까지 복 부에 있는 구멍에 한 블레이드를 밀어. 부드럽게 하 고 신속 하 게 복 부 세로로 잘라. 참고: 컷 했다 일단 복 부를 시작 한다 밖으로, 확장 이것 즉시 발생 하지 않을 수 있습니다 비록. 두 번째 컷, 가슴 아래와 첫 번째 컷 종료 보다 약간 측면 컷 될 수 있도록 진행. 참고: 복 부 해야 다음을 열고 가슴을 표 피와 AP 내 면 몰입 지방 기관에서 해리. 이 복 부 체 벽은 생체 외에서 문화에 대 한 뚱뚱한 몸을 준비. 집게의 쌍의 팁을 사용 하 여 APS 솔루션에서 지방 시체를 리프트 하 고 AP를 포함 하는 실 온에서 6 잘 플레이트에 솔루션에서 그들을 전송. 뚱뚱한 몸 문화에 전에 대략 0.5 h에 대 한 나머지 조직 허용. 4. 뚱뚱한 몸 문화 0.5 h 이상 그들을 equilibrate를 위한 실내 온도에 APS에 지방 시체를 품 어. 지방 시체는 집게의 팁을 사용 하 여 전송 하 고 부드럽게 APS 솔루션에서 그들을 들어 냅니다. 뚱뚱한 몸 문화 매체에는 팁 낮은. 참고: 뚱뚱한 몸 한다 매체의 표면에 열고 자유롭게 떠. 뚱뚱한 몸 문화 각 우물에서 매체의 150-200 µ L 96 잘 접시에서 일반적으로 수행 됩니다. 하나 잘 최대 3 개의 개별 지방 기관, 들어갈 수 있는 그리고 그들은 이상의 12 h (게시 되지 않은 개인 결과)에 대 한 가능한. 잠복기, 후 지방 시체에서에서 전송 매체 다운스트림 처리에 대 한 적절 한 시 약을 포함 하는 원심 분리기 1.5 mL 튜브에. 참고: 일반적인 분석 포함 정량 16 , 17 , 18 , 19, 서양 blotting 18 , 20, transcriptomics 26, proteomics 21 또는 대사체학 22.