תרבות הגוף השמן איברים במערכת Aedes Aegypti, וקטור של וירוס Zika
Summary
שומן הגוף הוא האיבר מטבולית במרכז בחרקים. אנו מציגים מערכת תרבות איברים חיים המאפשרת למשתמש ללמוד את התגובות של רקמות הגוף השמן מבודד לגירויים שונים.
Abstract
שומן הגוף חרקים ממלאת תפקיד מרכזי חילוף החומרים חרקים, אחסון מזון, שיקוף פונקציות של הכבד, רקמת שומן חולייתנים. רקמות הגוף השמן חרקים מופץ בדרך כלל בכל הגוף חרקים. עם זאת, לעיתים קרובות מרוכז בבטן, מחובר לקיר הגוף בבטן.
יתוש שומן הגוף הוא המקור הבלעדי של חלמון חלבונים, אשר הם קריטיים עבור ייצור הביצים. לכן, התרבות במבחנה של רקמות שומן הגוף יתושים מייצג מערכת חשובה זו לחקר יתושים פיזיולוגיה, חילוף החומרים, ובסופו של דבר, ביצים. התהליך תרבות הגוף השמן מתחיל עם ההכנה של פתרונות, ריאגנטים, כולל פתרונות מניות חומצת אמינו, אאדס תמיסת מלח פיזיולוגית מלח מניות פתרון (APS), פתרון מניות סידן בינוני תרבות הגוף השמן. התהליך ממשיך עם חיתוך שומן הגוף, ואחריו טיפול ניסיוני. לאחר הטיפול, מגוון רחב של ניתוחים שונים ניתן לבצע, כולל RNA רצף (RNA-Seq), qPCR, שהכלים המערבי, פרוטאומיקס, מטבולומיקס.
בניסוי שלנו למשל, נדגים את הפרוטוקול באמצעות כריתה ותרבות של שומן הגוף של היתוש קדחת צהובה, Aedes aegypti, וקטור העיקרי של arboviruses כולל קדחת דנגה, chikungunya Zika. RNA מגופים שומן תרבותי תחת מצב פיזיולוגי ידוע upregulate חלבונים חלמון לעומת הפקד היו RNA-Seq ניתוח כדי להדגים את התועלת פוטנציאלי של הליך החקירות של ביטוי גנים.
Introduction
היתושים הם וקטורים של מחלות האדם הרסנית, לרבות מלריה, קדחת דנגה, chikungunya Zika1,2,3. למרות אינטנסיבי המאמצים הבינלאומיים לרסן מחלות אלה וכדי לשלוט להעברת המחלה אוכלוסיות יתוש, התפרצות מגפת המחלות בעקיצות יתוש הן עדיין נפוץ, במיוחד במדינות מתפתחות. חיסונים יעילים נגד רבים של מחלות אלו הן אינו זמין או של יעילות מוגבלת4,5. הדרך היעילה ביותר למנוע התפרצויות היא לשלוט אוכלוסיות יתוש, בעיקר באמצעות שימוש בקוטלי חרקים טיפולים. עם זאת, עמידות חרקים יש שפותחה אוכלוסיות יתושים רבים ולהיות בעיה נפוצה ברחבי העולם6,7,8. המחקר של יתוש פיזיולוגיה חיוני להתפתחות של הרומן כלים ואסטרטגיות כדי לשלוט במחלה.
יתוש שומן הגוף ממלאת תפקיד מרכזי לאחסון מזון, הומאוסטזיס מטבולית, רבייה, קטבוליזם xenobiotic9,10,11,12. זה האיבר האחסון המרכזי עבור טריגליצרידים, גליקוגן וחומצות אמינו בצורה של חלבוני. הוא מתפקד גם המיקום של סינתזה עבור רוב החלבונים hemolymph של מטבוליטים. יתושים, שומן הגוף הוא המקור הבלעדי של ייצור החלבון חלמון המתרחשת אצל נקבות לאחר שהם לוקחים ארוחת דם13,14.
סוג התא העיקרי של שומן הגוף הוא גדול, polyploid trophocyte או adipocyte3,9,10,12. רקמת שומן גוף שמאורגנים אונות או עטיפות, ניתן למצוא כל חלקי הגוף של היתוש, עם החלק הגדול ביותר ממוקם בבטן, איפה אונות גדולה של שומן הגוף מחוברים לקיר הבטן הגוף.
מערכת תרבות הגוף השמן יתושים המובאת כאן פותחה בשנות ה-70 ונותרה כלי רב עוצמה עבור לומד הגוף השמן פיזיולוגיה10, במיוחד בשילוב עם טכנולוגיות אנליזה הנוכחית. הבסיס של טכניקה זו מבוססת על בידודו של הקירות גוף הבטן ואת הרקמה המשויך שומן הגוף. מהות הידרופובי הקוטיקולה הבטן גורם לו לצוף על פני השטח של המדיום תרבות, עם האונות המצורפת של הגוף השמן בטן שקועה. Spiracles ואת המבנה tracheolar נשמרים, הבטחת חמצון של בתרבית רקמה. מעתה ואילך, נתייחס ההכנות הללו “שומן גופות.” בודדים גופות שומן נשארות קיימא עבור יותר מ 12 שעות כאשר מתפשט בתוך המדיום המתאים (שלא פורסמו תוצאות). תרבות הגוף השמן הוא כלי בעל ערך יש לטפל בהן מגוון של שאלות לגבי הגוף השמן אנדוקרינולוגיה ופיזיולוגיה9,10,12,15,16, 17.
בתרבית שומן הגוף יכולה להיות נתונה שונות ניסיוני ושליטה טיפולים, העיתוי של אשר יכול להיות הוחלט על ידי החוקר. בסוף תקופת הדגירה, הגופים שומן ניתן לאסוף ולהשתמש מעובד עבור ניתוחים במורד הזרם, כולל qPCR16,17,18,19, ווסטרן סופג18 ,20, פרוטאומיקס21או גליקומיקס22. ניתן לבצע ניסויים על סולמות שונים, מ בודדים גופות שומן לקבוצות של מאות זה יכול להיות תרבותי ביחד.
התוצאות נציג כלולים כאן נגזר שומן גוף תרבותי בנוכחות חומצות אמינו ו ecdysone הידרוקסי 20 של הורמונים סטרואידים כדי לדמות את ההפעלה ארוחת דם של16,vitellogenesis17, 23,24. אנו מנותח, בהשוואה בביטוי הגן דיפרנציאלית של לא מופעל נגד גופים שומן מופעל באמצעות ניתוח הדור הבא רצפי.
Protocol
Representative Results
Discussion
איברים חרקים התרבות היה בשימוש נרחב ללמוד אנדוקרינולוגיה חרקים, פיתוח, חילוף החומרים, כמו גם כדי לחקור את האינטראקציה בין איברים מסוימים אנחנו חיים איתם בסמביוזה חיידקי29,30,31, 32,33,34. In vitro לקשרי תרבות איבר הגוף השמן שימש במיוחד ללמוד חומצת אמינו תחבורה והסדרה של חלמון ייצור החלבון יתושים ואת שאר Diptera16,17,35 , 36. במהלך התהליך של vitellogenesis, יתוש שומן הגוף משתמש מערך של חומצת אמינו גבוהה-ירידה לפרטים מובילי לייבוא נגזר ארוחת דם חומצות אמינו hemolymph לסנתז כמויות גדולות של חלבונים חלמון12 ,19,35,36. תרבות הגוף השמן היה לכלי התיחום של הדרישות התזונתיות של הגוף השמן הזה בהקשר18.
איכות חומר המוצא, היתושים נקבה, היא קריטית להצלחת הניסויים. רימות היתוש העולות צפופות תחת תנאים וניזונו התזונתי גבוה דיאטות בדרך כלל לייצר את התוצאות הטובות ביותר. יש כמה משתנים חשובים שיש לקחת בחשבון בעת יצירת תנאים תרבות הגוף השמן יתושים במעבדה מבחינת עיצוב ניסיוני. הראנו במחקרים קודמים, ביטוי גנים שומן הגוף משתנה באופן משמעותי בהתאם כל סיפור חיי הפרט ואת המצב התזונתי של יתוש11,22. התנאים התרבות יתוש צריך להיות אחיד כדי להפחית את מידת ההשתנות בגודל, עתודות התזונתיים של היתושים ניסיוני. בנוסף, אנשי ביצוע והניתוחים בקיצור כדי להבטיח ניתוח מהיר ומדויק עם תוצאות עקביות. תא הכדאיות בגופים שומן מבודדים ניתן לבדוק באמצעות שונים מכתימים שיטות37,38.
הנבחנים של ניסוי תרבות הגוף השמן צריך לקחת בחשבון מספר והניתוחים אפשרי בתקופת זמן נתונה. כאשר נדרשים כמויות גדולות של שומן הגוף, הפעלות לנתיחה מרובות או dissectors מרובים ייתכן שיהיה צורך. יש מגוון רחב של יישומים עתידיים עבור in vitro לקשרי תרבות הגוף השמן בבית. יתושים וחרקים אחרים. זה יהיה שימושי במיוחד עבור בדיקות מועמדים פוטנציאליים סמים לבקרת מזיקים. השימוש בטכניקות הטרנסגניים בחרקים לבטא חלבונים ספציפיים כתב ב הגוף השמן trophocytes יפתח את שיטות חדשות כדי לפתח bioassays עוצמה עבור חקר הפיזיולוגיה של הגוף השמן.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענק-NIH #SC1AI109055, גרנט NMSU HHMI #52008103 2014, ו NSF PGR להעניק #1238731. אנו מודים המשתתפים של NMSU האביב 2015 BIOL302 מולקולרית שיטות מחלקה, בבהאטיה Lavesh לתמיכה טכנית שלהם עם הניסויים תרבות הגוף השמן.
Materials
| Scissors | Fiskars | 83872 | |
| Fly pad | Genesee Scientific | 789060 | |
| Battery-powered aspirator w/ collection vial | Hausherrs Machine Works, Inc. | 3740-01-210-2368 | |
| Fine tip forceps | World Precision Instruments, Inc. | 500085 | |
| Light microscope | Leica Microsystems | ||
| 96 well plate | Sigma | CL S3383 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Alanine | Sigma | A7627 | |
| Arginine | Sigma | A5006 | |
| Asparagine | Sigma | A0884 | |
| Aspartic Acid | Sigma | A9256 | |
| Cysteine | Sigma | W326305 | |
| Glutamic Acid | Sigma | G1251 | |
| Glutamine | Sigma | G3126 | |
| Glycine | Sigma | G2879 | |
| Histidine | Sigma | H6034 | |
| Isoleucine | Sigma | I2752 | |
| Lysine | Sigma | L5501 | |
| Leucine | Sigma | L8000 | |
| Phenylalanine | Sigma | P2126 | |
| Proline | Sigma | P0380 | |
| Serine | Sigma | S4500 | |
| Threonine | Sigma | T8625 | |
| Tryptophan | Sigma | T0254 | |
| Tyrosine | Sigma | T3754 | |
| Valine | Sigma | V0500 | |
| Methionine | Sigma | M9625 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgCl2-6H2O | Sigma | M2670 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| CaCl2-2H2O | Sigma | C8106 | |
| Tris pH8.0 | Sigma | T1503 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| ddH2O | Sigma | W4502 |
References
- Benelli, G., Mehlhorn, H. Declining malaria, rising of dengue and Zika virus: insights for mosquito vector control. Parasitol Res. 115 (5), 1747-1754 (2016).
- Newby, G., et al. The path to eradication: a progress report on the malaria-eliminating countries. Lancet. 387 (10029), 1775-1784 (2016).
- Clements, A. N. . The Biology of Mosquitoes. 2, (1992).
- Long, C. A., Zavala, F. Malaria vaccines and human immune responses. Curr Opin Microbiol. 32, 96-102 (2016).
- Mendis, K. N., David, P. H., Carter, R. Human immune responses against sexual stages of malaria parasites: considerations for malaria vaccines. Int J Parasitol. 20 (4), 497-502 (1990).
- Frings, S., Lindemann, B. Odorant response of isolated olfactory receptor cells is blocked by amiloride. J Membr Biol. 105 (3), 233-243 (1988).
- Froese, A., Szyszka, P., Menzel, R. Effect of GABAergic inhibition on odorant concentration coding in mushroom body intrinsic neurons of the honeybee. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 183-195 (2014).
- Yewhalaw, D., et al. Multiple insecticide resistance: an impediment to insecticide-based malaria vector control program. PLoS One. 6 (1), e16066 (2011).
- Arrese, E. L., Soulages, J. L. Insect fat body: energy, metabolism, and regulation. Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2010).
- Raikhel, A. S., Deitsch, K. W., Sappington, T. W., Crampton, J. M., Beard, C. B., Louis, C. . The Molecular Biology of Insect Disease Vectors: A Methods Manual. , 507-522 (1997).
- Price, D. P., et al. The fat body transcriptomes of the yellow fever mosquito Aedes aegypti, pre- and post- blood meal. PLoS One. 6 (7), e22573 (2011).
- Hansen, I. A., Attardo, G. M., Rodriguez, S. D., Drake, L. L. Four-way regulation of mosquito yolk protein precursor genes by juvenile hormone-, ecdysone-, nutrient-, and insulin-like peptide signaling pathways. Front Physiol. 5, 103 (2014).
- Raikhel, A. S., Dhadialla, T. S. Accumulation of yolk proteins in insect oocytes. Annu Rev Entomol. 37, 217-251 (1992).
- Raikhel, A. S., et al. Molecular biology of mosquito vitellogenesis: from basic studies to genetic engineering of antipathogen immunity. Insect Biochem Mol Biol. 32 (10), 1275-1286 (2002).
- Hansen, I. A., Attardo, G. M., Chandrasekar, R. Ch. 6. Short Views on Insect Molecular Biology. , (2009).
- Hansen, I. A., Attardo, G. M., Park, J. H., Peng, Q., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-mediated amino acid signaling in mosquito anautogeny. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (29), 10626-10631 (2004).
- Hansen, I. A., Attardo, G. M., Roy, S. G., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-dependent activation of S6 kinase is a central step in the transduction of nutritional signals during egg development in a mosquito. J Biol Chem. 280 (21), 20565-20572 (2005).
- Attardo, G. M., Hansen, I. A., Shiao, S. H., Raikhel, A. S. Identification of two cationic amino acid transporters required for nutritional signaling during mosquito reproduction. J Exp Biol. 209 (Pt 16), 3071-3078 (2006).
- Carpenter, V. K., et al. SLC7 amino acid transporters of the yellow fever mosquito Aedes aegypti and their role in fat body TOR signaling and reproduction. J Insect Physiol. 58 (4), 513-522 (2012).
- Attardo, G. M., Higgs, S., Klingler, K. A., Vanlandingham, D. L., Raikhel, A. S. RNA interference-mediated knockdown of a GATA factor reveals a link to anautogeny in the mosquito Aedes aegypti. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (23), 13374-13379 (2003).
- Hugo, L. E., et al. Proteomic biomarkers for ageing the mosquito Aedes aegypti to determine risk of pathogen transmission. PLoS One. 8 (3), e58656 (2013).
- Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti. Parasit Vectors. 8, 252 (2015).
- Uchida, K., et al. Induction of oogenesis in mosquitoes (Diptera: Culicidae) by infusion of the hemocoel with amino acids. J Med Entomol. 38 (4), 572-575 (2001).
- Uchida, K., Ohmori, D., Yamakura, F., Suzuki, K. Changes in free amino acid concentration in the hemolymph of the female Culex pipiens pallens (Diptera: Culicidae), after a blood meal. J Med Entomol. 27 (3), 302-308 (1990).
- Hayes, E. Determination of a physiological saline solution for Aedes aegypti .(L). J Econ Entomol. 46 (4), 624-627 (1953).
- Price, D. P., et al. The Fat Body Transcriptomes of the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti, Pre- and Post Blood Meal. Plos One. 6 (7), e22573 (2011).
- Chomczynski, P., Mackey, K. Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide-and proteoglycan-rich sources. Biotechniques. 19 (6), 942-945 (1995).
- Fujiwara, T., Kazawa, T., Haupt, S. S., Kanzaki, R. Postsynaptic odorant concentration dependent inhibition controls temporal properties of spike responses of projection neurons in the moth antennal lobe. PLoS One. 9 (2), e89132 (2014).
- Larsen, W. P. Growth in an insect organ culture. J Insect Physiol. 13 (4), 613-619 (1967).
- Judy, K. J., et al. Isolation, Structure, and Absolute Configuration of a New Natural Insect Juvenile Hormone from Manduca sexta. Proc Natl Acad Sci USA. 70 (5), 1509-1513 (1973).
- Marks, E. P. The action of hormones in insect cell and organ cultures. Gen Comp Endocrinol. 15 (2), 289-302 (1970).
- Hughes, G. L., Pike, A. D., Xue, P., Rasgon, J. L. Invasion of Wolbachia into Anopheles and Other Insect Germlines in an Ex vivo Organ Culture System. PLoS One. 7 (4), e36277 (2012).
- Postlethwait, J. H., Handler, A. M. Roles of Juvenile-Hormone and 20-Hydroxy-Ecdysone during Vitellogenesis in Isolated Abdomens of Drosophila melanogaster. J Insect Physiol. 25 (5), 455-460 (1979).
- Spielman, A., Gwadz, R. W., Anderson, W. A. Ecdysone-initiated ovarian development in mosquitoes. J Insect Physiol. 17 (10), 1807-1814 (1971).
- Boudko, D. Y., et al. Substrate specificity and transport mechanism of amino-acid transceptor Slimfast from Aedes aegypti. Nat Commun. 6, 8546 (2015).
- Fleischer, J., Bumbalo, R., Bautze, V., Strotmann, J., Breer, H. Expression of odorant receptor Olfr78 in enteroendocrine cells of the colon. Cell Tissue Res. 361 (3), 697-710 (2015).
- Jones, K. H., Senft, J. A. An improved method to determine cell viability by simultaneous staining with fluorescein diacetate-propidium iodide. J Histochem Cytochem. 33 (1), 77-79 (1985).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. A3B, (2001).
