Un modello di topo transgenizzato IL-8 per il<em> In Vivo</em> Monitoraggio a lungo termine delle risposte infiammatorie
Summary
Il metodo descritto qui consente la visualizzazione dell'attivazione dell'infiammazione dipendente dal promotore IL-8 nei polmoni dei topi attraverso la bioluminescenza non invasiva (BLI). Lo stesso animale può essere sottoposto a più volte BLI per un massimo di due mesi a partire dal momento della consegna del costruttore di reporter luciferasi.
Abstract
L'infiammazione delle vie aeree è spesso associata a infezioni batteriche e rappresenta un determinante importante della malattia polmonare. La determinazione in vivo delle capacità proinfiammatorie di vari fattori è impegnativa e richiede procedure terminali, come lavaggio broncoalveolare e rimozione dei polmoni per analisi in situ , escludendo la visualizzazione longitudinale nello stesso topo. Qui, l'infiammazione del polmone è indotta attraverso l'instillazione intratracheale del supernatante di coltura Pseudomonas aeruginosa (SN) in topi transientemente transgeniati che esprimono il gene reporter del luciferasi sotto il controllo di un promotore bovino eterologo IL-8. L'espressione della luciferasi nel polmone è controllata dall'analisi bioluminescente (BLI) in vivo su un tempo di 2,5 a 48 ore dopo l'instillazione. La procedura può essere ripetuta più volte entro 2 – 3 mesi, consentendo così la valutazione della risposta infiammatoria negli stessi topi conLa necessità di terminare gli animali. Questo approccio consente di monitorare in tempo reale i fattori pro e anti-infiammatori che agiscono nel polmone e sembra adatto per studi funzionali e farmacologici.
Introduction
Malattie polmonari croniche, come l'asma, la malattia polmonare cronica ostruttiva (BPCO), la fibrosi cistica (CF) e la bronchiectasia, sono caratterizzati da infiammazioni delle vie aeree. L'infiammazione delle vie aeree è caratterizzata da edema, infiltrazione cellulare, linfocita T e attivazione delle cellule mastiche, aumento delle secrezioni delle vie aeree e deposizione eccessiva di collagene. CF è un disturbo multisystem e la sua principale causa di mortalità e morbilità è l'infezione batterica polmonare con aggravamento dell'esacerbazione polmonare. Il declino della funzione polmonare prevede un risultato significativamente più povero 1 , 2 , 3 , 4 .
Lo stato infiammatorio del tratto respiratorio è solitamente osservato attraverso la valutazione di marcatori immunologici reclutati durante il processo infiammatorio in materiale derivato dalle vie aeree inferiori e superiori, come l'espettorato, che fornisce resistenza variabileULT. Le broncoscopie sono anche eseguite 5 . I modelli murini sono strumenti preziosi per indagare la patogenesi e l'evoluzione delle malattie caratterizzate da infiammazioni delle vie aeree e per i quali non sono ancora stati identificati trattamenti o cure efficaci. I modelli animali di infezione polmonare e infiammazione sono stati utilizzati per studiare l'interazione tra asma e patogeno, compreso il ruolo di sostanze chimiche che simulano le condizioni umane ( es. Esposizione al fumo di sigarette, LPS, elastasi, ovalbumina, poli I: C ecc. Nonché combinazioni di quanto sopra) 6 . La misura dei parametri legati all'infiammazione richiede il sacrificio degli animali, in quanto sono necessari approcci invasivi per misurare fattori quali il carico batterico, le citochine nei polmoni e il fluido di lavaggio broncoalveolare (BAL). Inoltre, gli esami istologici sono spesso necessari. La possibilità di ottenere informazioni sulla cinetica di risposta infiammatoria richiede l'uso di numTopi erosi. Pertanto, una tecnica che consentirebbe di ottenere tali informazioni senza la necessità di sacrificare gli animali è preziosa su basi tecniche, etiche, economiche e operative.
IL-8 è un giocatore essenziale nel processo infiammatorio, recluta leucociti al tessuto infiammato. Rappresenta una lettura molecolare per lo studio dell'attivazione della via infiammatoria. MIP-2 e KC possono essere omologhi funzionali di umano IL-8 nei topi. I topi esprimono solo un potenziale recettore IL-8, un omologo del CXCR2 umano 7 , 8 , ma sono in grado di modulare un promotore di gene ET-8 eterologo che guida un gene reporter. Un modello murino di infiammazione polmonare è stato recentemente sviluppato dopo l'osservazione che un topo bovino IL-8 promotore / luciferasi reporter construct può essere transactivated nei topi. Questa caratteristica consente l'utilizzo della bioluminescenza imaging (BLI) per monitorare la risposta infiammatoria nel vivere unNomi 9 .
Questo modello è stato adattato per studiare l'infiammazione attivata da esoproduzioni batteriche ( ad es. LPS o prodotti rilasciati da ceppi batterici) o TNFalfa 10 , 11 . Il processo di scoperta di droga è incentrato sullo sviluppo e l'ottimizzazione di vecchie e nuove molecole antinfiammatorie che possono trattare le malattie polmonari, come CF, asma e BPCO. Queste nuove entità chimiche devono essere testate rapidamente e convenientemente in modelli animali che possono essere collegati a specifici fenotipi clinici per facilitare la progettazione di studi clinici intelligenti.
Protocol
Representative Results
Discussion
In un precedente lavoro 11 , è stato mostrato un contrasto tra i marcatori BLI e BAL dipendenti da bIL-8-Luc. Si è basata sul grado differenziale di sensibilità all'interno dei ceppi del mouse 12 . Per questa ragione, la prima applicazione del modello bIL-8-Luc su un diverso ceppo di topi richiede uno studio iniziale della risposta infiammatoria, sia in termini di BLI che di marcatori infiammatori più standardizzati.
La trasfezione dei …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Progetto FFC n. 18/2013, FFC # 29/2015 e dalla Lega Cistica Fibrosa Italiana attraverso la Federazione Italiana di Fibrosi Cistica (Associazione Veneta Lotta contro la Fibrosi Cistica Onlus).
Materials
| FMT 2500 Fluorescence Tomography System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| IVIS Lumina serie II Pre-clinical In Vivo Imaging System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| MMPsense 750 FAST | Perkin Elmer Inc. | NEV10001EX | Protect from light, store the probe at 4 °C |
| Female inbred BalbC | Harlan Laboratories Italy | Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions | |
| bIL-8-Luc plasmid | Department of Medical Veterinary Science, University of Parma, Italy | Store the plasmid at -20 °C | |
| pGL3basic vector | Promega | E1751 | Store the vector at -20 °C |
| JetPEI DNA transfection reagent | Polyplus transfection | 201B-001G | The DNA and JetPEI mix was formulated with a final N/P ratio of 7 |
| D-luciferin potassium salt 1g | Perkin Elmer Inc. | 122796 | Protect from light, store at -20 °C |
| Living Image software | Caliper Life Sciences, | Experimental Builder | |
| Isoflurane | ESTEVE spa | 571329.8 | Do not inhale |
| Bio-Plex Cytokine Assay Kit | Bio-Rad Laboratories | M60-009RDPD | Store the unopened kit at 4 °C |
| Automated cell counter | Dasit XT 1800J | Experimental Builder | |
| Penn-century model DP-4M Dry power insufflator | Penn-century | DPM-EXT | |
| Gas anesthesia system XGI-8 | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| PE190 micro medical tubing | 2biological instruments snc | BB31695-PE/8 | |
| Syringe without needle 5ml | Terumo | SS*05SE1 | Cut the boards of the piston by a scissors |
| Hamilton 0,10 ml (model 1710) | Gastight | 81022 | |
| Discofix 3-way Stopcock | Braun | 4095111 | |
| Syringe with needle 1ml | Pic solution | 3,071,260,300,320 | Use without needle |
| Plastic feeding tubes 18ga x 50mm | 2biological instruments snc | FTP-18-50 | Cut obliquely the tip |
References
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