Un enfoque ADN afinidad G-cuádruplex para la purificación de enzimáticamente activa G4 Resolvase1
Summary
G4 Resolvase1 se une a estructuras de G-quadruplex (G4) con la afinidad reportado más apretado para una proteína de unión-G4 y representa la mayoría de la G4-ADN anulación actividad en las células HeLa. Se describe un nuevo protocolo que aprovecha la afinidad y anulación actividad dependiente de ATP de G4-Resolvase1 para purificar específicamente G4R1 recombinante catalíticamente activo.
Abstract
estructuras de ácidos nucleicos de orden superior llamado G-quadruplex (G4s, estructuras G4) se pueden formar en las regiones ricas en guanina del ADN y ARN y de alta estabilidad térmica. Hay> 375.000 secuencias de formación de G4-putativo en el genoma humano, y que se enriquecen en regiones promotoras, regiones no traducidas (UTRs), y dentro de la repetición telomérica. Debido a la posibilidad de que estas estructuras afectan a los procesos celulares, tales como la replicación y transcripción, la célula ha evolucionado enzimas para su gestión. Una de estas enzimas es G4 resolvasa 1 (G4R1), que bioquímicamente fue co-caracteriza por nuestro laboratorio y Nagamine et al. y encontrado que se unen muy fuertemente a ambos G4-DNA y RNA-G4 (K d en el intervalo de bajo pM). G4R1 es la fuente de la mayoría de la actividad G4-resolver en lisados de células HeLa y desde entonces ha sido implicado a desempeñar un papel en el metabolismo de los telómeros, el desarrollo de la linfa, la transcripción de genes, la hematopoyesis, y la vigilancia inmune. La capacidad a EFcientemente expresar y purificar catalíticamente activa G4R1 es de importancia para los laboratorios interesados en adquirir una mayor comprensión de la interacción cinética de las estructuras y las enzimas G4 G4-resolver. A continuación, describimos un método detallado para la purificación de G4R1 recombinante (rG4R1). El procedimiento descrito incorpora la tradicional de purificación basados en la afinidad de una enzima marcada con histidina C-terminal expresada en bacterias con codones optimizados humanos con la utilización de la capacidad de rG4R1 de unirse y descansar G4-ADN para purificar la enzima altamente activo en un ATP- etapa de elución dependiente. El protocolo también incluye una etapa de control de calidad, donde la actividad enzimática de rG4R1 se mide mediante el examen de la capacidad de la enzima purificada para relajarse G4-ADN. Un método se describe también que permite la cuantificación de rG4R1 purificado. Se discuten las adaptaciones alternativas de este protocolo.
Introduction
estructuras G4 son estructuras secundarias de ácidos nucleicos altamente estables que se forman dentro de las regiones ricas en guanina del ADN y ARN. Estructuras G4 se estabilizan a través de interacciones Hoogsteen enlazantes y coordinan unión dentro de la cavidad central con cationes monovalentes (es decir. K + y Na +) que contribuyen significativamente a la notable estabilidad térmica de las estructuras G4 1, 2. Los primeros estudios sugirieron que la bioinformática el genoma humano contiene> 375.000 "potenciales formar G4-motivos" 3, 4. Estimaciones del estudio más recientes sugieren que el número de motivos G4 es mayor en un factor de 2 a 5 mayo, mientras que otro estudio predice 716,310 potenciales secuencias de formación de G4-distintas en el genoma humano 6. G4 formador de secuencias están evolutivamente conservada y no dispersa aleatoriamente enel genoma. Motivos G4 se enriquecen en regiones codificantes de genes, y más del 40% de todos los promotores de genes contienen motivos G4 7. Curiosamente, el grado de enriquecimiento de motivos G4 en un gen se ha demostrado para sugerir la función del gen. Por ejemplo, los proto-oncogenes y genes implicados en el desarrollo tienen significativamente mayor enriquecimiento de las estructuras G4 que los genes supresores de tumores 8, 9.
Con altas estabilidades térmicas, una presencia casi omnipresente en todo el genoma, y el potencial de afectar significativamente los procesos celulares, no es sorprendente encontrar que la célula ha evolucionado enzimas para gestionar estas estructuras. Una de estas enzimas es G4 Resolvase1 (G4R1; también llamado Rhau y DHX36), que se caracterizó como la fuente de la mayoría de tetramolecular G4-ADN actividad resolver en las células humanas (HeLa) 10. Desde entonces, se ha demostrado that G4R1 fuertemente se une y catalíticamente desenrolla tetramolecular y unimolecular G4-DNA y RNA-G4 con los KDs reportados más ajustados para una proteína de unión G4-11, 12, 13. Además, la actividad G4-resolución de G4R1 se ha implicado en una amplia gama de procesos bioquímicos y celulares, incluyendo la biología de los telómeros / telomerasa 11, 14, 15, 16, transcripción y corte y empalme 17, 18, 19, 20, el desarrollo 21, la hematopoyesis 21, y la regulación inmune 22, 23. Con una preponderancia de las secuencias G4 específicamente situado a lo largo del genoma y la diversa p celularrocesos que G4R1 recientemente se ha implicado de estar involucrado con, la capacidad de expresar y purificar eficientemente altamente activa rG4R1 será de suma importancia para dilucidar los mecanismos bioquímicos y comportamientos de esta proteína.
Aquí, demostramos una novela expresión y esquema de purificación (Figura 1) que se aprovecha de la dependiente de ATP, la actividad G4-resolución de rG4R1 para aislar eficientemente enzima activa. Este sistema podría ser adaptado para purificar otras enzimas de ácido nucleico dependientes de ATP para el cual el producto de la reacción enzimática ya no es un sustrato para la unión, como es el caso de G4R1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo representa una expresión, purificación, y el esquema de cuantificación altamente eficiente para el aislamiento del producto génico DHX36, G4-Resolvase1 (G4R1, también llamado Rhau y DHX36) (Figura 1). Este protocolo utiliza dos etapas de purificación: Su-etiqueta de purificación de afinidad en perlas de afinidad de cobalto y purificación enzimática sobre perlas G4-ADN-conjugado. El último paso es único, ya que se aprovecha de la afinidad apretado, alta especificidad, y anulaci?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a nuestras fuentes de financiación, incluyendo una generosa donación de la Fundación Ware (a JPV), los Institutos Nacionales de HealthGrant T32-CA079448 (para PJS), y los fondos de inicio de la Ball State University (a PJS). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.
Materials
| TriEx4-DHX36 plasmid | Addgene | 68368 | |
| Rosetta2(DE3)plysS competent cells | Novagen | 71403-4 | |
| S.O.C medium | Thermo Fisher Scientific | 15544034 | |
| Difco Terrific Broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | 35 µg/ml in bacterial plates/large cultures |
| Carbenicillin (plant cell culture tested) | Sigma-Aldrich | C3416 | 50 µg/ml in bacterial plates/large cultures |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| Lysozyme (from chicken egg white) | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| 1 M Tris-HCl pH=8 | Universal Scientific Supply Co. | 1963-B | or From standard source |
| 1 M Tris-HCl pH=7 | Universal Scientific Supply Co. | 1966 | or From standard source |
| 1.5 M Tris-HCl, pH=8.8 | For casting resolving gel (for protein quantitation gel); From standard source | ||
| 1 M Tris-HCl, pH=6.8 | For casting stacking gel (for protein quantitation gel); From standard source | ||
| 1 M Tris-Acetate, pH=7.8 | Universal Scientific Supply Co. | 1981 | or From standard source |
| 70% Ethanol | From standard source | ||
| Magnesium chloride (1 M solution) | Life Technologies | AM9530G | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S8750 | |
| 20x SSC | Universal Scientific Supply Co. | 1665 | or From standard source |
| β-mercaptoethanol (2-BME) | Sigma-Aldrich | 63689 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8849 | |
| Leupeptin hemisulfate | Sigma-Aldrich | L8511 | |
| Streptavidin paramagnetic beads | Promega | Z5482 | |
| 0.5 M EDTA, pH=8 | Universal Scientific Supply Co. | 0718 | or From standard source |
| 0.2 M EDTA, pH=6 | Universal Scientific Supply Co. | From standard source; initially adjust pH with NaOH, then adjust pH back down with HCl. | |
| A-lactalbumin (Type 1 from bovine milk) | Sigma-Aldrich | L5385 | |
| Cobalt metal affinity beads | Clonetech | 635502 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8000 | |
| Acetic acid, glacial | Fisher Scientific | A38-500 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (from bacterial source) | Sigma | A7699 | |
| 40% acrylamide/Bis solution (37.5:1) | Biorad | 161-0148 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS) |
| 10 % Sodium dodecyl sulfate | Universal Scientific Supply Co. | 1667 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); or From standard source |
| 10x TBE | Sigma-Aldrich | 11666703001 | or From standard source |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); From standard source |
| TEMED | Sigma-Aldrich | 411019 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Broad Range Protein MW markers | Promega | V8491 | |
| Biotinylated Z33 oligo ("Z33-Bio") | Oligos Etc | 5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3’ | |
| TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM") | Oligos Etc | 5’ TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3’ | |
| Fluor-coated TLC plate | Life Technologies | AM10110 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F2637 | 30% in H2O |
| Coomassie R-250 | Sigma-Aldrich | 27816 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Multiband UV lamp | Capable of emitting UV light at 365 nm | ||
| Table-top centrifuge (with swinging bucket rotor) | Capable of being cooled to 4 °C | ||
| Microcentrifuge | Capable of being cooled to 4 °C | ||
| Digital Sonfier | Branson | Or equivalent capable of delivering sonication pulses (30% amplitude, 2s ON 2s OFF) | |
| 50 °C water bath | For formation of Z33 into quadruplex | ||
| 37 °C incubator for bacteria | For bacterial transformations and initial overnight growth of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36 | ||
| 37 °C/14 °C shaking incubator for bacteria | For growth and protein induction of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36 | ||
| Spectrophotometer | capable of reading OD600; capable of reading oligomer concentrations based on base sequence (such as Biorad SmartSpec 3000) | ||
| Thermometer | From standard source | ||
| PCR strip tubes | From standard source | ||
| 15- and 50-ml centrifuge tubes (polypropylene) | From standard source | ||
| Microcentrifuge tubes (2.0 ml) | From standard source | ||
| 500 ml centrifuge bottles (polypropylene) | Thermo Scientific | 3141-0500 | |
| Standard array of pipet tips and serological pipettes | From standard source | ||
| Gel-loading tips | From standard source | ||
| Automatic repeating pipette | For quick aliquoting of rG4R1; From standard source | ||
| Thermal cycler | From standard source | ||
| Liquid Nitrogen | From standard source | ||
| Dry ice | From standard source | ||
| Laemlli sample buffer | Biorad | 161-0737 | |
| Apparatus for running large slab gels | Biorad | We have used the Protean II xi cell apparatus from Biorad | |
| Magnet | Life Technologies | 12301D | We use a magnet from One Lambda (Now a Thermo Fisher Scientific brand); and Life is also a subsidiary of Thermo, and thus the magnet listed here should be a suitable replacement |
| Razor blades | From standard source | ||
| Filter paper and funnel | From standard source | ||
| Glass casserole dish | From standard source | ||
| Orbital shaker | From standard source | ||
| Kimwipes | From standard source | ||
| Clear sheet protectors | From standard source | ||
| Scanner and associated TWAIN software | From standard source | ||
| Image analysis software | Such as Fuji Multiguage, or equivalent | ||
| Microsoft Excel | Or equivalent |
References
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