In vivo הדמיה של ביטוי מהונדס ג'ין הפרט רשתית אבות ב Chimeric דג הזברה עוברים לחקר השפעות Cell Nonautonomous

היכולת לחזות תהליכים התפתחותיים חשובים בתוך חוליות vivo ב תרמה להפיכת דג הזברה כמודל מפתח ללימוד תנאים נורמלים ומחלות (הנסקרת ב ^{1, 2).} בפרט, הרשתית העצבית היא חלק בלתי נגיש של מערכת העצבים המרכזית. הרשתית משאיל את עצמו לבצע מחקרים בקלות הנוירוגנזה בשל מבנהו מאורגן, אך פשוט יחסית, וסוגים נוירון שלה שמור ביותר על פני מינים בעלי חוליות ^3. דינמיקה של התנהגויות הסלולר כגון התפשטות, יציאת מחזור התא, חלוקת תא סימטרית, מפרט גורל, בידול, והיווצרות מעגלים עצבית ניתן בעקבות לאורך כל התהליך של retinogenesis, אשר הושלם ברשתית המרכזית של דג הזברה על ידי 3 ד postfertilization ( ^{4 DPF), 5,}נ"צ "> ^{6, 7.}

יתר על כן, הדרישות הפונקציונליות של גנים שונים בכל השלבים שהוזכרו לעיל ניתן להעריך בו זמנית ברשתית דג הזברה, מתן יתרון על פני דגמים חוליות אחרים בהם פנוטיפים וכתוצאה מיישום של טכניקות נוקאאוט גנטי ניתן להעריך רק בבדיקה שלאחר המוות של קבוע רקמות. בפרט, השימוש בקווים מהונדסים שבו אנו יכולים לחזות את ולנטר את הביטוי של חלבוני ניאון כמו transgenes כתב ברשתית, מאפשר לנו להשיג החלטה זמנית של ביטוי גנים העומדים בבסיס ראשיתו של סוג תאים עצבי בפרט. בשל ההתפתחות המהירה של דג זברה, אירועים אלה ניתן דמיינו בתקופה התפתחותית כולו, ובכך לספק תובנה עמוקות יותר את החשיבות הזמנית של ביטוי גנים ביחס לרכישת זהות תאים עצבית ועל התנהגות תא.

לבסוף, גישות אלה ניתן לשלב ביעילות של דג הזברה עם הדור של הכימרה באמצעות השתלות, וכתוצאה מכך תובנות שני היבטים מרכזיים של תפקוד הגן. ראשית, בחינת תאים המושתלים מעובר תורם, שבו גן מסוים ופל תוך שהם מפתחים בסביבת סוג ברה ללא תווית, מאפשר לנו להשיג מידע רלוונטי על תפקוד גן באופן תא אוטונומי. זה מוביל לתובנות חשובות לגבי הפונקציה של גורמים הקובע גורל רשתית בתוך ובתאים הם באים לידי ביטוי בדרך כלל. זה בא לידי ביטוי על ידי בחינה של התוצאה גורל התפתחותי של אבות כי כבר לא יכול ליצור חלבון פונקציונלי מן הגנים האלה ^{4, 6, 8, 9.} ניצול גישה זו, הראינו כי גורמים הקובעים גורל רב (למשל, Vsx1, Atoh7, Ptf1a, Barhl2) לפעול תא-autonomously לנהוג גורלות עצביים ברשתית ספציפית; חוסר ביטוי גנים מוביל בעיקר למתג גורל, כך התאים עם גן המציאה להישאר קיימא על ידי אימוץ גורל ⁴ תאים ^{חלופי, 6, 7, 10.} שנית, ניסויי כימרי כזה יכול לשמש כדי להעריך כמה פרא סוג אבות להתנהג כאשר הם מפתחים בתוך סביבות גנטיות שונות. לדוגמא, על ידי השוואת התפתחות תאי WT שבדרך כלל לבטא את גן של עניין (ו transgene כתב) בתוך WT לעומת סביבת מארח מניפולציות (למשל, נוקאאוט גנטי / מציאה), את ההשפעות הנובעות על ביטוי גני גורל תא ניתן להעריך . חוסר סוגי נוירונים מסוימים בסביבת המארחת, למשל, מוכיח להשפיע על התנהגות אב סוג בר באופן תאים שאינם אוטונומי, להטות אותם לכיוון הבחנה לתוך o מיוצגת כראויr חסר סוגי נוירונים ^{4, 7, 11, 12.} בהתחשב בכך נוירונים ברשתית נולדים צו histogenic נשמר על ידי ביטוי מתוזמן ברצף של גנים הקובעים גורל ספציפיים עצביים (ביטוי גני גורל) (הנסקרת ב ^13), השתמשנו בשיטות אלה כדי להדגים כיצד התזמון של ביטוי גני גורל אבות סוג ברים מושפע כאשר אבות כאלה לפתח בסביבות מארח רשתית עם קומפוזיציות הסלולר סוטות מושרות. כאן, אנו מתארים גישות אלה כעדות איך השילוב לסטנדרטים יחסית בשימוש נרחב בטכניקות מאפשר בחינת המועדים של ביטוי גני גורל בפיתוח אבות רשתית ^{8, 9.}

פרוטוקול זה מתאר גישה ניסויית שילוב הדמיה זמן לשגות עם הקלות של לכללהרכיב השתלת בעובר דג הזברה פיתוח vivo לשעבר כדי לעקוב אחר תאים בודדים mosaically שכותרתו לאורך כל תקופת retinogenesis התפתחותית. על ידי ביצוע מניפולציות גן פונקציונלי או בעובר המארח, העובר התורם, שניהם או אף אחד, אפשר להעריך את האוטונומיה תאים של תפקוד הגן. גישה זו ניתן להתאים נרחבת לשאלות מחקר דומות בכל מערכת אחרת עבורו הרכיבים הבודדים המפורטים כאן מתאימים.