Ein Hochdurchsatz-Assay unterstützte Wirksamkeit von Medikamenten gegen Makrophagen agierten zur Bewertung<em> Mycobacterium tuberculosis</em
Summary
New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.
Abstract
The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.
Introduction
Tuberkulose (TB) bleibt eine ernsthafte globale Bedrohung für die Gesundheit trotz der Verfügbarkeit von Anti-TB – Chemotherapien seit über 40 Jahren ein. Dies ist zum Teil auf die Forderung nach langen Behandlungszeiten von mehr als 6 Monaten mehrere Arzneimittelkombinationen, die die Nichteinhaltung 2 zu Patient führt. Die Entstehung von arzneimittelresistenten TB in den letzten Jahren hat weitere Probleme in einem Bereich verstärkt , in der erfolgreiche Entwicklung klinisch zugelassenen Medikamente 3 praktisch nicht existent ist. Denn trotz erschöpfende Anti-TB – Medikamentenentwicklung, nur ein einziges Medikament für die klinische Anwendung FDA gewesen 4 in den letzten 40 Jahren zugelassen. So werden neue Generationen von Anti-TB-Medikamente sind dringend erforderlich, um dieses Problem zu lösen.
Ein wesentliches Problem bei der TB Drug Discovery ist der Mangel an erfolgreichen Transfer von Verbindungen mit de – vitro – Aktivität zur Wirksamkeit in der klinischen Einstellung= "Xref"> 5, 6, 7. Zunächst wurden Zielbasierte Ansätze verwendet 5 für Anti- Mtb Drogen zu screenen, die in ganze Bakterienzellen zu übersetzen ist fehlgeschlagen. Selbst wenn Mtb – Zellen verwendet werden, wird es oft durchgeführt Brühe gewachsenen Kulturen verwendet, die nicht genau Arzneimittelwirksamkeit in vivo 8, 9 vorherzusagen. Diese Probleme wurden erkannt und Wirkstoff – Screening – Assays gegen Makrophagen enthalten , Mtb oder latent Mtb wurden erfolgreich etabliert 8, 10, 11, 12. Aber auch diese erweiterte Tests geben keine ausreichende Berücksichtigung der Durchdringung Barrieren, die Drogen in den nicht-gefäßLungenLäsionen auftreten, und in der Nekrosen an der Stelle der Infektion. Tatsächlich, Auch für die First-Line – TB – Medikamente Rifampicin, suboptimale Dosierung wurde 13, 14, 15 als auch in vivo Gewebe und Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) Penetration aufgrund unzureichender in Frage gestellt als Wirksamkeit gegen intrazelluläre Mtb 8 verringert, 9. Als solche neue Modelle und Tests, die Berücksichtigung dieser Parameter während der frühen Führung Entwicklungsprozess zweifellos TB Drug Discovery nehmen würde Anstrengungen verbessern würde.
Um diesem Bedarf zu begegnen, wir eine kostengünstige, schnelle und BSL-2 – kompatible Alternative Infektionsmodell für Mtb Arzneimittelwirksamkeitsprüfung 16 vor kurzem etabliert. Diese Infektionsmodell produziert dicht Mtb verpackt in großen Makrophagen Aggregatstrukturen, die physiologisch relevante zelluläre Penetrationsbarrieren rekapituliert und erzeugt Makrophagen-agierten <em> Mtb mit einem veränderten physiologischen Zustand latenten Mtb ähnelt. Mtb von dieser Infektion Modell abgeleitet wurde mit dem Resazurin Mikrotitertest (REMA) kombiniert Wirksamkeit von Medikamenten zu bewerten, die mit der berichteten Fähigkeit von gemeinsamen TB – Medikamente Ergebnisse im Einklang mit anderen intrazellulären Infektionsmodellen und korreliert gut produziert hohen CSF – Konzentrationen in Bezug auf Serumkonzentrationen erzielen 16.
Hier beschreiben wir ausführlich in der Erzeugung von Mtb / Makrophagen – Aggregatstrukturen Makrophagen-agierten Mtb geeignet für die Arzneimittelempfindlichkeitstests unter Verwendung von REMA herzustellen. Insbesondere zeigen wir, wie diese Infektion System auf eine 96-Well-Format für die Kompatibilität mit Durchsatz-Screening von Kandidaten-Anti-TB-Medikamente angepasst werden könnte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier haben wir im Detail eine alternative Mtb – Infektionsmodell geeignet für die Arzneimittelwirksamkeitstests beschrieben. Dieses Modell berücksichtigt zwei wichtige Faktoren , die eine stärkere Berücksichtigung in der frühen TB Arzneimittelentwicklung gegeben werden sollte: das Vorhandensein von physiologisch relevanten Hindernisse für Arzneimittelpenetration und metabolischen Veränderungen von Mtb während der Infektion. Während wir früher die Vorteile unserer Infektionsmodell gezeigt habe…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Frank Wolschendorf for access to the Cytation 3 automated imaging plate reader. This work was funded in part by NIH grant R01-AI104499 to OK. Parts of the work were performed in the UAB CFAR facilities and by the UAB CFAR Flow Cytometry Core/Joint UAB Flow Cytometry Core, which are funded by NIH/NIAID P30 AI027767 and by NIH 5P30 AR048311.
Materials
| 7H9 | BD Difco | 271310 | Follow manufacturer's recommendations |
| Middlebrook OADC | BD Biosciences | 212351 | |
| Tyloxapol | Sigma | T8761 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma | P5710 | Prepare 24 mg/ml stock solution in H2O; filter sterilize |
| L-leucine | MP Biomedicals | 194694 | Prepare 50 mg/ml stock solution in H2O; filter sterilize |
| Hygromycin B | EMD Millipore | 400051 | Prepare 200 mg/ml stock solution in H2O |
| Nalgene Square PETG media bottle | Thermo Fisher | 2019-0030 | |
| RPMI 1640 media | Hyclone | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| L-glutamine | Corning | MT25005CI | |
| HEPES | Hyclone | SH30237.01 | |
| Cytation 3 plate reader | Biotek | Interchangable with any fluorescent plate reader and microscope | |
| Gen5 Software | Biotek | Recording and analysis of rezasurin coversion | |
| Rifampicin | Fisher Scientific | BP2679250 | Prepare 10 mg/ml stock solution in H2O |
| Moxifloxacin Hydrochloride | Acros Organics | 457960010 | Prepare 10 mg/ml stock solution in H2O |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | Prepare 800 μg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164500 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
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