Análisis de una sola partícula de alta resolución a partir de imágenes de crosmicroscopía electrónica usando SPHIRE
Summary
Este artículo presenta un protocolo para el procesamiento de imágenes cryo-EM utilizando la suite de software SPHIRE. El presente protocolo se puede aplicar para casi todos los proyectos EM de partículas individuales que apuntan a la resolución casi atómica.
Abstract
SPHIRE (SPARX para Microscopía Electrónica de Alta Resolución) es una novedosa suite de software de código abierto y fácil de usar para el procesamiento semiautomático de datos de cryo-microscopía electrónica de partículas individuales (cryo-EM). El protocolo presentado aquí describe detalladamente cómo obtener una estructura de resolución casi atómica a partir de las películas de micrografía crio-EM guiando a los usuarios a través de todos los pasos de la tubería de determinación de estructura de una sola partícula. Estos pasos se controlan desde la nueva interfaz gráfica de usuario SPHIRE y requieren una intervención mínima del usuario. Usando este protocolo, una estructura de 3,5 Å de TcdA1, un complejo de toxina Tc de Photorhabdus luminescens , se derivó de sólo 9500 partículas individuales. Este enfoque simplificado ayudará a los usuarios principiantes sin experiencia extensa de procesamiento e información estructural a priori , para obtener modelos atómicos libres de ruido e imparcial de sus complejos macromoleculares purificados en su estado nativo.
Introduction
Después del desarrollo de la tecnología de detector de electrones directos, el notable progreso en el crio-EM de partícula única está reformando la biología estructural 1 . En comparación con la cristalografía de rayos X, esta técnica requiere sólo una pequeña cantidad de material proteico sin la necesidad de cristalización, al mismo tiempo que plantea menos restricciones con respecto a la pureza de la muestra y todavía permite la determinación de estructuras a una resolución casi atómica. Es importante destacar que diferentes composiciones o estados pueden ahora ser separados computacionalmente y la determinación de la estructura de las diferentes conformaciones puede llevarse a cabo a un nivel de detalle sin precedentes. Recientemente, los mapas de densidad de moléculas desafiantes podrían producirse en resoluciones que permitan la construcción de modelos de novo y, por tanto, una comprensión profunda de su modo de acción 2 , 3 , 4 , 5.
Una amplia variedad de paquetes de software de procesamiento de imágenes están disponibles en la comunidad 3DEM (3D Electron Microscopy) (https://en.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy) y la mayoría de ellos están bajo desarrollo continuo. Se ha alcanzado una resolución casi atómica para proteínas que exhiben diversos pesos moleculares y simetrías con varios paquetes de software diferentes, incluyendo EMAN2 6 , IMAGIC 7 , FREALIGN 8 , RELION 9 , SPIDER 10 y SPARX 11 . Cada paquete requiere un nivel diferente de experiencia del usuario y proporciona un nivel diferente de guía del usuario, automatización y extensibilidad. Además, mientras que algunos programas proporcionan entornos completos para facilitar todas las etapas del análisis de imágenes, otros están diseñados para optimizar tareas específicas, como el refinamiento de parámetros de alineación a partir de un rEstructura de eferencia. Más recientemente, se han desarrollado varias plataformas, incluyendo APPION 12 y SCIPION 13 , que proporcionan una única tubería de procesamiento que integra enfoques y protocolos de los diferentes paquetes de software enumerados anteriormente.
Para contribuir al desarrollo actual del cryo-EM, SPARX fue re-desarrollado en una nueva plataforma autónoma y completa para análisis de partículas individuales, llamada SPHIRE (SPARX para Microscopía Electrónica de Alta Resolución). Con el fin de aumentar la accesibilidad de la técnica para los nuevos investigadores en el campo y para hacer frente a la gran cantidad de datos producidos por modernos microscopios electrónicos totalmente automatizados de gama alta, la tubería de procesamiento fue rediseñado y simplificado mediante la introducción de un fácil de usar Interfaz gráfica de usuario (GUI) y la automatización de los pasos principales del flujo de trabajo. Además, se añadieron nuevos algoritmos para permitir la determinación rápida, reproducible y automatizada de la estructura de crYo-EM imágenes. Además, se introdujo la validación por reproducibilidad para evitar artefactos comunes producidos durante el análisis de refinamiento y heterogeneidad.
A pesar de que el programa fue ampliamente modificado, se mantuvieron sus apreciadas características básicas: código abierto de código abierto, el moderno diseño orientado a objetos y interfaces Python para todas las funciones básicas. Por lo tanto, no se cambió en un programa de cuadro negro, lo que permite a los usuarios a estudiar y modificar fácilmente el código Python, para crear aplicaciones adicionales o modificar el flujo de trabajo global. Esto es especialmente útil para proyectos cryo-EM no estándar.
Aquí presentamos un protocolo para la obtención de un mapa de densidad de resolución casi atómica de imágenes cryo-EM utilizando la GUI de SPHIRE. Describe en detalle todos los pasos necesarios para generar un mapa de densidad a partir de películas de detección directa cryo-EM crudas y no está restringido a ningún tipo particular de macromolécula. Este protocolo pretende principalmente guiar a newcOmers en el campo a través del flujo de trabajo y proporcionar información importante sobre los pasos cruciales del procesamiento, así como algunos de los posibles obstáculos y obstáculos. Las características más avanzadas y los antecedentes teóricos detrás de SPHIRE serán descritos en otra parte.
Protocol
Representative Results
Discussion
El cryo-EM de partícula única ha mostrado un rápido desarrollo en los últimos años y ha proporcionado numerosas estructuras de resolución atómica de complejos macromoleculares de mayor importancia biológica 25 . Con el fin de apoyar el gran número de usuarios principiantes que actualmente están entrando en el campo, desarrollamos la plataforma de análisis de imágenes de una sola partícula SPHIRE y presentamos aquí un protocolo para todo el flujo de trabajo incluyendo la alineación de películas, picking de partículas, CTF estimación, modelo inicial Cálculo, análisis de heterogeneidad 2D y 3D, refinamiento 3D de alta resolución y estimación y filtrado de resolución local.
El protocolo descrito aquí pretende ser una breve guía para la determinación de la estructura en 3D usando micrografías crio-EM de la proteína de interés y con la ayuda de herramientas computacionales proporcionadas por la GUI autónoma de SPHIRE.
La principal característica del flujo de trabajo es que la mayoríaDe los procedimientos sólo se deben ejecutar una vez, ya que se basan en el concepto de validación por reproducibilidad [ 19] y no requieren ajuste de parámetros. Este mecanismo de validación automática es una ventaja principal de SPHIRE sobre otros paquetes de software ya que los resultados tienden a ser objetivos, así como reproducibles y, lo más importante, obtenibles a un coste computacional aceptable. El oleoducto proporciona además una gran cantidad de información de diagnóstico para que los usuarios experimentados realicen una validación y evaluación independiente con métodos propios. Sin embargo, un usuario principiante que tenga al menos un fondo teórico elemental en biología estructural y microscopía electrónica debería ser capaz de obtener estructuras de resolución casi atómicas utilizando datos propios y los procedimientos automatizados de validación.
Sin embargo, la obtención de una estructura de resolución casi atómica no siempre es directa y el resultado dependerá en gran medida de la calidad de la muestra y de la entrada quea. Para los procedimientos presentados aquí, se supone que un número suficiente de alta calidad no alineados primas películas EM están disponibles, con sus promedios que muestran claramente discernible homogénea y aleatoriamente orientada partículas individuales. En general, no hay restricciones en cuanto a simetría, tamaño o forma general de la molécula, pero un bajo peso molecular puede ser un factor limitante, especialmente cuando la proteína tiene una forma globular sin rasgos distintivos. Por lo general, el análisis de partículas grandes y bien ordenadas con una simetría de grupos de puntos altos es menos exigente. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente a los usuarios principiantes que ejecuten el protocolo actual primero con un conjunto de datos cryo-EM bien caracterizado. Los datos del tutorial SPHIRE (http: /sphire.mpg.de) o uno de los conjuntos de datos enviados por EMPIAR (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/) con películas crudas son un buen punto de partida .
Al procesar datos propios, es muy probable que algunos conjuntos de datos o algunas de las imágenes no satisfagan ciertos requisitosCriterios de selección. En este contexto, además de las verificaciones automatizadas de estabilidad y reproducibilidad, realizadas por el programa para los pasos principales del flujo de trabajo, sigue siendo recomendable para los usuarios inspeccionar visualmente los resultados en ciertos "puntos de control" del protocolo, especialmente si la reconstrucción final No es satisfactoria.
La primera inspección visual puede hacerse a nivel de micrografía después de la alineación de la película ( Paso 2 del protocolo) y la estimación CTF ( paso 3 del protocolo). Los promedios corregidos por movimiento resultantes deben mostrar partículas claras y bien separadas y sus espectros de potencia deben mostrar anillos Thon claramente visibles e isotrópicos. La frecuencia espacial a la que son visibles define, en la mayoría de los casos, la resolución más alta a la que en principio se puede determinar la estructura. Ejemplos de un promedio de corrección de movimiento de calidad suficiente y su espectro de potencia se muestran en la sección & #34. Resultados representativos "Las imágenes atípicas que podrían tener un impacto negativo en el resultado final pueden eliminarse con la ayuda de las herramientas GUI de Drift y CTF de SPHIRE (http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php).
Con respecto a la detección de partículas, la etapa crucial en la tubería SPHIRE es la clasificación 2D utilizando ISAC ( paso 5.2 del protocolo ) . En este caso, el usuario debe controlar que los promedios de clase 2D reproducibles identificados automáticamente por el programa adopten una gama de orientaciones suficientes para cubrir casi uniformemente el espacio angular. Si la calidad de los promedios de clase no es satisfactoria (imágenes ruidosas y / o borrosas) y / o el número de promedios de clase reproducibles es muy bajo, considere la posibilidad de mejorar la calidad de selección automática, optimizar la formación de imágenes o la preparación de muestras. En la mayoría de los casos, no es posible calcular una reconstrucción fiable a partir de un conjunto de datos que no genere buenos promedios de clase 2D. Ejemplos de alta calidad 2D clase aveEn la sección "Resultados representativos".
Se requieren al menos 100 promedios de clase para obtener un modelo 3D inicial confiable usando RVIPER de una manera automatizada ( Paso 6.1 del protocolo). Para este paso, el usuario debe seleccionar los promedios con la calidad más alta e incluir tantas orientaciones diferentes de la partícula como sea posible. La calidad del modelo inicial es crítica para el éxito del posterior refinamiento 3D de alta resolución.
En otros paquetes de software, la clasificación 3D se realiza a veces para eliminar las partículas "malas" 8 , 9 . Sin embargo, en SPHIRE la mayoría de estas partículas se eliminan automáticamente ya durante la clasificación 2D usando ISAC. Por lo tanto, se recomienda realizar el paso computacional intensivo de clasificación 3D sólo si la reconstrucción y el análisis de variabilidad 3D indican heterogeneidad del conjunto de datos.
Lo más importante es que el usuario debe inspeccionar cuidadosamente los volúmenes 3D resultantes cuidadosamente ( paso 9.3 del protocolo) y confirmar que las características de la densidad respectiva coinciden bien con la resolución nominal. A una resolución <9 Å, las densidades similares a las barras correspondientes a las hélices α se hacen visibles. Con una resolución <4,5 Å, las densidades correspondientes a las hebras de las láminas β suelen estar bien separadas y los voluminosos aminoácidos se vuelven visibles. Un mapa de alta resolución (<3 Å) debe mostrar claramente discernible cadenas laterales, lo que permite la construcción de un modelo atómico exacto.
Los resultados obtenidos hasta la fecha demuestran que, con la ayuda de las pruebas de reproducibilidad automatizadas de SPHIRE y las mínimas inspecciones visuales, el presente protocolo es generalmente aplicable a cualquier tipo de proyecto de crio-EM de partículas individuales. Se muestran resultados representativos de cada etapa de procesamiento para la reconstrucción de la toxina TcdA1 dePhotorhabdus luminescens 21 , que se ha resuelto hasta una resolución casi atómica. Los mapas de densidad de calidad similar se pueden utilizar para construir modelos atómicos confiables mediante el trazado de novo de la columna vertebral así como el refinamiento recíproco o real-espacio, y así proporcionar un marco estructural sólido para la comprensión de mecanismos moleculares complejos.
CÓDIGOS DE ACCESIÓN:
Las coordenadas de la estructura EM y las películas sin procesar se han depositado en el Banco de Datos de Microscopía Electrónica y en el Archivo de Imágenes Piloto de Microscopía Electrónica bajo los números de registro EMD-3645 y EMPIAR-10089, respectivamente.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a D. Roderer por brindarnos las micrografías TcdA1. Damos las gracias a Steve Ludtke por su apoyo constante de la infraestructura EMAN2. Este trabajo contó con el apoyo de fondos de la Sociedad Max Planck (SR) y del Consejo Europeo en el marco del Séptimo Programa Marco de la Unión Europea (FP7 / 2007-2013) (subvención nº 615984) y de los Institutos Nacionales de Salud R01 GM60635 a PAP).
Materials
| SPHIRE | Max Planck Institute of Molecular Physiology- Dortmund and Houston Medical School, Houston, Texas | http://sphire.mpg.de | |
| UCSF Chimera | University of California, San Francisco | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | |
| Unblur | Janelia Farm Research Campus, Ashburn | http://grigoriefflab.janelia.org/unblur | |
| Coot | MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge | http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | |
| EMAN2 | Baylor College of Medicine, Houston | http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2 | |
| Computing Cluster with 1824 cores | Max Planck Institute of Molecular Physiology | Linux Cluster with 76 nodes, each with 2 Processors Xeon E5-2670v3 12C 2.30 GHz and 128 Gb RAM | |
| TITAN KRIOS electron microscope | FEI | 300 kV, Cs correction, XFEG | |
| Falcon II direct electron detector | FEI | ||
| EPU (automated data acquisition software) | FEI | https://www.fei.com/software/epu/ |
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