使用SPHIRE的电子冷冻显微镜图像的高分辨率单粒子分析

注意：要遵循此协议，必须在具有MPI安装的系统（目前为Linux群集）上正确安装SPHIRE。从http://www.sphire.mpg.de下载SPHIRE和TcdA1数据集，并按照安装说明进行操作：http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php?id=howto:download。此过程也安装EMAN2。 SPHIRE目前使用EMAN2的e2boxer进行粒子选择和e2显示来显示图像文件。对于原始显微照片电影的剂量加权运动校正，SPHIRE使用unblur 14 。下载程序并按照安装说明进行操作（http://grigoriefflab.janelia.org/unblur，Grigorieff实验室）。为了对结果进行交互式可视化，协议将使用分子图形程序Chimera 15 （https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html）。熟悉本协议中使用的功能的一个很好的教程可以是fou在这里：https：//www.cgl.ucsf.edu/chimera/data/tutorials/eman07/chimera-eman-2007.html。有关如何从SPHIRE GUI将并行作业提交到集群的说明，请参见：http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php?id=howto:submissions。 SPHIRE GUI的整体组织以及整个协议中执行的工作流程的主要步骤如图1所示 。 1.项目：设置本项目的常量参数值通过在终端窗口中键入“ sphire＆”和ENTER键启动SPHIRE GUI应用程序。 在项目设置页面的相应输入字段中调整项目范围的参数（ 例如，像素大小，粒子半径和对称性），然后为工作流程的所有后续步骤注册这些值。 点击左侧面板右下方的“PROJECT”图标打开项目设置页面。 <li>使用e2display.py图像交互显示工具测量粒子的最长轴，然后将粒子的一半输入“蛋白质粒子半径”。如果测量值为Å，请记住使用像素大小将单位转换为像素（ 例如，如果粒子长度为200埃，像素尺寸为1.2埃/像素，则粒子的最长轴为200 / 1.2 =〜166像素，半径166/2 = 83像素）。 将“粒子大小”设置为粒径的至少1.5倍。避免包含大素数的窗口大小。另外，请记住，3D细化算法目前需要偶数的盒子大小。 注意：窗口应包含一个余量，以解决由于采摘（需要在窗口中移动颗粒）而产生的初始居中误差以及颗粒边界之外的足够的背景区域进行适当的CTF校正（对于大的离焦值尤其重要） <sup class ="“xref”"> 16）。 将“CTF窗口大小”设置为“粒子大小”。对于具有低对比度数据的项目，使用较大的窗口来获得更平滑的功率谱估计。 设定复合体的“点组对称性”（ 例如 “C5”）。如果目标结构的对称性未知，则将其保留为“C1”（不对称）。然而，如果在处理期间稍后识别特定的高阶对称性，则相应地改变该对称性设置，并且在与ISAC进行2D对准之后重复步骤。 将“蛋白质分子质量”设置为kDa（近似值就足够了）。按“注册设置”按钮。 2.电影：对齐每个电影显微镜的框架，以校正样品的整体运动 对于所有电影显微照片，计算所有帧的x / y移位，然后创建其剂量未加权和剂量加权修正后的平均值（见讨论）。注意，前者仅对于CTF估计是必要的，因为估计与剂量加权平均值不能很好地进行，而后者用于结构确定的所有其他步骤。 点击“电影”图标，然后点击“显微照片对齐”按钮。通过选择可执行文件设置“Unblur可执行路径”。通过选择原始未对齐的电影显微照片并用通配符“*”替换文件名的可变部分（ 例如， TcdA1 _ *。mrc）来设置“输入显微图像路径模式”。指定“输出目录”的路径。 通过选择可执行文件设置“Summovie可执行路径”。 将“电影帧数”设置为每个电影显微照片中的帧数。将“显微镜电压”和“每帧曝光”设置为数据采集期间使用的值。 （例如：le，如果总体剂量为60 e – /Å2，20帧记录无预曝光，每帧曝光为60/20 = 3 e – / A 2 ）按“运行命令”按钮对齐每个电影的照片显示。 注意：这将自动创建两个输出目录，分别包含 剂量未加权和剂量加权的运动校正平均显微照片。 3. CTER：估计CTF的散焦和散光参数 对于每个剂量未加权的平均显微照片，估计CTF参数（散焦和散光;其他由用户设定）。 单击“CTER”图标，然后单击“CTF估计”按钮。要设置“输入显微图像路径模式”，请选择剂量未加权的运动校正显微照片，然后用通配符替换文件名的可变部分“*”。另外，指定“输出目录”的路径。 将“幅度对比度”设置为实际使用的数据类型（冰厚度是主要因素）和显微镜电压（ 例如 10％）。典型值在7 – 14％范围内17 。 设置数据采集期间使用的“显微镜球面像差（Cs）”和“显微镜电压”。 将CTF模型的搜索范围的“最低频率”和“最高频率”分别设置为0.0285和0.285Å -1 （40 – 4Å）。按“运行命令”按钮来估计CTF参数。 注意：CTF参数将自动存储在指定输出目录中的partres.txt文件中。在96个核心上计算出112个显微照片的CTF估计值，并在Linux集群上〜3分钟后完成，用于获得代表性的结果。 4.窗口：从剂量加权平均显微照片提取颗粒 用e2boxer 6从显微照片手动或自动选择颗粒，并创建坐标文件，每个文件包含相关显微照片中的粒子xy坐标列表。 点击“窗口”图标，然后点击“粒子拾取”按钮。按“运行命令”按钮启动e2boxer 6 ，手动或自动选择每个显微照片的粒子18 （参见讨论 ）。将每个显微照片的最终粒子坐标存储在EMAN1文件格式（.box）中。或者，在将它们转换为EMAN1格式后，从其他程序导入坐标文件。 通过从剂量加权显微照片中提取粒子图像来创建粒子堆栈（在SPHIRE中，粒子堆栈是简称“堆栈”）。 按“粒子提取”按钮。通过选择剂量加权运动校正的显微照片，然后用通配符“*”替换文件名的可变部分（ 例如， TcdA1 _ * .mrc）来指定“输入显微图像路径图案”。同样，通过选择坐标文件（ 例如， TcdA1 _ *。box）来设置“输入坐标路径模式”。指定“输出目录”的路径。 通过选择CTF参数文件（步骤3.1中生成的partres.txt）设置“CTF参数源”。按“运行命令”按钮。 将提取的粒子图像堆叠合并成一个。 点击“粒子堆栈”按钮。使用BDB文件路径格式（ 例如， “bdb：粒子/堆栈”）指定“输出虚拟映像堆栈”的路径，其中“粒子”指向e目录中包含名称始终为EMAN2DB的BDB数据库目录，“stack”是指此数据库中的特定映像堆栈）。通过选择以“mpi_proc”开头的目录指定“输入BDB图像堆栈模式”，然后用通配符“*”替换目录名称的变量部分（ 例如， Particles / mpi_proc_000到Particles / mpi_proc_ *）。按“运行命令”按钮。 ISAC：2D中粒子图像的分类 通过对齐粒子并根据其2D外观将其聚类，计算2D类平均值。 注意：所得到的2D平均值与单个粒子图像相比具有改进的信噪比（SNR），因此用于可视化地评估数据集的质量和异质性，以及从堆栈中分类不期望的图像（ 例如，冰晶，碳边，聚集，碎片等 ） 19 。此外，它们将被随后用于确定初始3D模型。 单击“ISAC”图标，然后单击“ISAC – 2D聚类”按钮。通过选择包含提取的粒子的堆栈文件，输入“输入图像堆栈”。指定“输出目录”的路径。 对于“每个图像”使用200 – 1000。选择适当的数量，考虑到2D类的预期数量（总数量除以每个类别的图像数量）。根据SNR和数据集的大小调整此参数。如果数据集过于嘈杂，请增加每个成员的数量。当有少量颗粒可用时减少数量。 注意：由于内存限制，对于相当大的数据集（> 100,000个粒子），将完整的数据集拆分为子集，为每个子集独立地执行ISAC，并结合结果结束了。有关此处理方案的详细说明，请参见http://www.sphire.mpg.de/wiki/doku.php。 检查“相位翻转”复选框。保持“目标粒子半径”和“目标粒子图像大小”的默认值，以便通过使用这些设置自动收缩所有粒子图像来加快过程。按“运行命令”按钮计算2D类平均值。 注意：此步骤在计算上要求很高，随着粒子数量和类别以及目标半径和图像大小的增加，运行时间会显着增加。在具有96个过程的群集上，约10,000个粒子的2D分类在约90分钟后完成。 显示和目视检查所得到的ISAC 2D平均值，以确保其质量令人满意（参见讨论）。 按“实用程序”下的“显示数据”按钮。设置“;通过选择包含ISAC 2D平均值（步骤5.1中生成的class_averages.hdf）的文件，输入文件“按”运行命令“按钮显示由ISAC提供的最终可再现和验证的类别平均值。 创建一个新的堆栈，只包含验证类平均值的粒子成员。 按“创建堆叠子集”按钮。通过选择与5.1.1中相同的堆栈文件来设置“输入图像堆栈”。通过选择ISAC 2D平均值（步骤5.1中生成的class_averages.hdf）设置“ISAC平均值”。指定“输出目录”的路径。按“运行命令”按钮。 VIPER：计算初始3D模型 通过删除粒子的所有不良类别平均值和相同视图来选择一组小的平均值（≥100图像）（参见讨论），并使用它们来计算代表使用VIPER的可变初始模型。请记住，选择应至少包含60-80个高质量平均值，每个成员约200-500个。 点击“VIPER”图标，再点击“显示数据”按钮。通过选择ISAC 2D平均值（步骤5.1中生成的class_averages.hdf）设置“输入文件”。按“运行命令”按钮。 在e2显示图形窗口的某处按鼠标中键，并在弹出的窗口中激活“DEL”按钮。删除粒子的所有坏类平均值和相同视图（参见讨论 ）。按“保存”按钮将剩余的2D类平均值存储到新文件中。 从所选的ISAC平均值中，为后续的3D细化生成初始参考。 点击“初始3D模型 – RVIPER”按钮。通过选择筛选的类来设置“输入图像堆栈”平均值（在步骤6.1中生成）。指定“输出目录”的路径。 确保使用相同的值作为ISAC步骤5.1.3的“目标粒子半径”。按“运行命令”按钮生成可重复的从头开始的 3D模型。 注意：此步骤在计算上要求很高，运行时间随着粒子数的平均值和大小而显着增加。在具有96个进程的集群上，该作业（〜100类平均）在〜15分钟后完成。 通过考虑类别平均值以及其结构完整性（ 即没有断开的部件和/或方向假象），检查所得到的3D模型是否合理。要显示地图，请使用程序Chimera 15 。此时，如果存在目的蛋白质的同源蛋白或结构域的晶体结构，则进行第一次比较（一个例子显示在Represe结果）。 对于随后的3D细化，通过去除其周围的噪声并重新缩放以便与原始像素大小相匹配，从起始3D模型生成初始3D参考和3D掩模。 点击“创建3D参考”按钮。通过选择ab initio 3D模型（步骤6.2中生成的average_volume.hdf）设置“输入音量”。指定“输出目录”的路径。 通过选择ISAC收缩率文件（步骤5.1中生成的README_shrink_ratio.txt）设置“重采样比率源”。按“运行命令”按钮。 7. MERIDIEN：优化初始3D体积 从初始3D模型开始，优化3D体积。 点击“MERIDIEN”图标，然后点击“3D细化”按钮。通过sele设置“输入图像堆栈”和“初始3D参考”调整粒子堆栈和从头的 3D模型（分别在步骤5.3和6.4中生成）。指定“输出目录”的路径。 通过选择3D蒙版文件（步骤6.4中生成）设置“3D蒙版”。始终使用3D蒙版，但特别是在分析的早期阶段，使用宽松配合参考的球形蒙版或软边蒙版，以避免引入不正确掩蔽的偏差。 选中“应用硬2D面具”复选框。将“起始分辨率”设置在20 – 25之间的截止频率值。请记住，具有该截止频率的低通滤波器将应用于初始3D结构以减少初始模型偏差。 检查此过程使用的集群规范，然后将“每个节点的内存”设置为可用内存（以GB为单位）。按“运行命令”按钮，以完全自动化的方式从初始3D模型开始优化3D体积。 <br />注意：此过程将数据集分成两半，独立细化两个模型，并输出两个原始卷，每个只有一半的粒子。在计算上要求很高，运行时间会随着粒子数量的增加而显着增加。在这个群集上，经过192次处理（约8,000个粒子，352个盒子大小）运行约2.5小时之后，子午线细化完成。 从精炼的体积创建一个软边3D面具，用于随后的锐化步骤。 点击“自适应3D蒙版”按钮。通过选择一个未过滤的半容量（步骤7.1中生成）来设置“输入音量”。指定“输出掩码”的路径。 设置“二值化阈值”值。使用嵌合体确保在这个特定的阈值下，未经过滤的半图谱的溶剂区域中的噪声显然超出感兴趣体积，蛋白质的所有密度仍然为c彼此连接。按“运行命令”按钮创建软边3D面具。 注意：所得掩模的主体（由体素值大于0.5的体素组成）应紧密配合颗粒结构，但仍包含所有感兴趣的密度。软边缘掉落应至少为8-10像素宽。 合并通过3D细化获得的两个未过滤的半体积。然后，通过基于检测器的调制传递函数（MTF），估计的B因子和FSC（傅里叶壳相关）估计的分辨率来调整功率谱来锐化合并的体积。 选择“锐化”按钮。通过选择相应的文件（步骤7.1中生成的vol_0_unfil.hdf和vol_1_unfil.hdf），设置“第一个未过滤的半容量”和“第二个未过滤的半容量”。始终使用“B因子增强”。通常，保持默认值为e使用最终分辨率和10Å之间的范围，从输入数据集中调整B因子值。或者，指定ad-hoc值（ 例如， -100）。 保持“低通滤波频率”的默认值，以应用基于FSC的滤波器。 通过选择3D面具（步骤7.2中生成）设置“用户提供的面具”。请记住，报告的分辨率将使用带有该掩码的FSC确定。按“运行命令”按钮来锐化精细的3D体积。 从上述3D细化步骤估计的所有粒子的投影方向生成3D角度分布图。 点击“角度分布”按钮。通过选择文件（步骤7.1中生成的final_params.txt）设置“对齐参数文件”，然后按“运行命令”按钮。 使用Chi目视检查锐化的3D模型梅拉。考虑到解决方案，确保结构看起来是合理的（参见讨论 ）。 使用嵌合体目视检查角度分布。验证分布大致均匀地覆盖整个3D角度空间。记住，对于对称结构，分布在独特的不对称三角形内受到限制。 8. SORT3D：通过关注高度可变区域对3D异质性进行排序 从3D细化中使用的粒子堆计算3D变异图。 点击“SORT3D”图标，然后点击“3D Variability Estimation”。通过选择给予3D细化步骤7.1.1的相同的筛选粒子堆，设置“输入图像堆栈”。指定“输出目录”的路径。 保留“投影数量”的默认值。 注意：来自角邻居的图像引擎盖将用于估计每个3D投影角度的2D方差。数字越大，估计噪声越小，分辨率和旋转伪像越低。 选中“使用CTF”复选框。按“运行命令”按钮。 使用3D变异图创建下面的3D聚类步骤的聚焦蒙版。 选择“二进制3D蒙版”按钮。通过选择3D可变性图（步骤8.1中生成）设置“输入音量”。指定“输出掩码”的文件路径。 通过使用嵌入式“Volume Viewer”中“Level”字段的输出设置“二值化阈值”。按“运行命令”按钮。 通过关注结构上高度可变的区域，将粒子图像分解成均匀的结构基团。 按“3D聚类 – RSORT3D”按钮。通过选择3D细化的输出目录（步骤7.1中生成）设置“输入3D细化目录”。指定“输出目录”的路径。 通过选择软边3D面具（步骤7.2中生成）设置“3D面具”。通过选择二值化的3D变异图（步骤8.2中生成）设置“聚焦3D面具”。 对于大型数据集，对于“每组图像”使用至少5,000-10,000。请记住，程序总是保持每组的图像数量低于此设置。通过考虑预期的3D组数（粒子总数除以“每组图像”值），数据集，SNR和异质性程度来调整该值。如果有足够数量的粒子可用，则开始〜5-10个初始3D组，除非预期数据集中具有更多数量的不同结构状态。 使用至少3,000-5,000粒子作为“最小组大小”。请注意，程序将忽略包含比“最小组大小”设置少的图像组。按“运行命令”按钮执行3D聚类。 注意：RSORT3D分为两个步骤。第一个“sort3d”步骤排除了3D异质性。然后，使用由上述3D细化步骤确定的3D对准参数来重构每个均匀结构组的体积。第二个“rsort3d”步骤通过执行两个独立排序运行的双向比较，发现每个组的可重复成员。然后，它仅使用可重复分配的粒子重构均匀结构。在具有96个核心的集群中，这项工作（约8,000个粒子，352个盒子大小）在约3小时后完成。 程序完成后，使用嵌套来选择均匀的3D组。选择最高表观分辨率的结构，通常与最多的po相关联可怜的团体通过考虑到所关注的蛋白质的2D类别平均值和生物学方面，确保选择的结构在视觉上是合理的（参见讨论 ）。如果在类似分辨率下有其他体积具有几乎相同结构的结构，则认为它们从单个均匀3D组中出现。 对最均匀的3D组（具有最高分辨率）的粒子成员进行局部细化。 点击“本地子集优化”按钮。通过选择包含所选组的粒子ID的文本文件（ 例如，在步骤8.3中生成的Cluster0.txt）来设置“子集文本文件路径”。通过选择先前3D细化的输出目录（步骤7.1中生成）来设置“3D细化目录”。 将“重新启动迭代”设置为在之前的3D细化中实现最高分辨率的迭代。按“运行命令”按钮执行所选粒子群的局部细化。 与步骤7.2类似，从由本地子集细化重建的未过滤的最终半容量创建软边3D面具。 与步骤7.3类似，合并由本地子集细化导出的两个未过滤的最终半体积，并锐化​​合并的体积。但是，这次不要过滤锐化的音量。 注意：如果步骤8.4中的异质性分析在可比较的分辨率下表示几种不同的状态，则可能希望独立地改进所有不同的状态。 9. LOCALRES：估算最终3D体积的本地分辨率 估计从均匀的粒子集获得的3D体积的局部分辨率。 点击“LOCALRES”图标，然后点击“本地分辨率”按钮。设置“上半部分”和“下半部分”- 通过选择本地子集细化的未过滤的最终半体积（在步骤8.5中生成），通过选择步骤8.6中产生的软边3D面具设置“3D掩模”，指定“输出体积”的文件路径， 。 保持“FSC窗口大小”的默认值7像素。请记住，此设置定义了计算局部 – 空间相关性的窗口的大小;较大的窗口大小以牺牲本地可解析性为代价产生更平滑的分辨率图。 保持“分辨率截止”的默认值0.5为分辨率标准。 注意：对于每个体素，程序会将本地分辨率报告为本地FSC低于所选分辨率阈值的频率。不建议阈值低于0.5，因为较低的相关值具有较高的统计学不确定性。因此，相应的局部分辨率将在体素之间变化很大。 对于“Overa”ll分辨率“，在本地子集细化后设置在锐化中估计的绝对分辨率（步骤8.7）。按”运行命令“按钮计算卷的本地分辨率。 通过使用3D局部分辨率图，将本​​地子集细化后的3D局部滤镜应用于锐化的体积。 点击“3D Local Filter”按钮。通过选择锐化但未过滤的3D体积（步骤8.7中生成）设置“输入音量”。类似地，设置“本地分辨率文件”和“3D掩码”（分别在步骤9.1和8.6中生成）。请记住，3D遮罩定义将应用本地过滤的区域。指定“输出卷”的文件路径。按“运行命令”按钮应用3D本地过滤器。 使用嵌合体来目视检查最终的3D模型和3D局部分辨率图（在步骤9,2和9.1中分别生成）ectively）。选择“表面颜色”选项，根据本地分辨率对3D体积进行着色。请记住，地方决议的分配应该顺利（参见讨论 ）。