Imagerie en direct de l'activité par Human Antifongique primaire neutrophiles et des monocytes en réponse à<em> A. fumigatus</em

Le protocole pour l' obtention de neutrophiles et des cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) sont basées sur les méthodes publiées antérieurement 9. L'utilisation d'échantillons de sang provenant de volontaires sains a été approuvé par le comité d'éthique de la recherche humaine de l'Université d'Aberdeen. Avant de commencer assurez-vous que toutes les approbations éthiques sont en place pour prélever du sang chez des volontaires sains et / ou des patients dans le but de l'expérience décrite. Gardez les cellules sur la glace si possible d'augmenter leur survie. 1. A. fumigatus Culture et conditions Préparer un milieu d' agar minimal de glucose comme décrit 10. Ajuster médias à pH 6,5 en utilisant du NaOH 1 M et autoclave à 120 ° C pendant 20 min. Laisser refroidir à 65 ° C. Travailler dans une hotte à flux stérile, verser 30 ml de milieu refroidi dans un flacon T75 et on laisse refroidir le col du ballon reposant sur une pipette de 25 ml à créer incliné de gélose. Série de la DsRed Af293- souche de A. fumigatus sur la gélose et incuber pendant 7 jours à 37 ° C + 5% CO 2. Deux flacons donneront environ 10 9 conidies dans une solution saline 5 tamponnée au phosphate mL (PBS) pré-biotinylation. 2. A. fumigatus étiquetage et préparation Remarque: Lors de cet essai pour la première fois, préparer le Af293- parental souche de A. fumigatus. Prélever des échantillons des deux souches dans des tubes de microcentrifugation et étiqueter un seul de chaque souche comme décrit ci-dessous. Cela permettra d'avoir une conidies de contrôle sans couleur et conidies avec une seule couleur, soit DsRed ou AF633, pour tester la configuration et de l'équipement. Récolte A. fumigatus conidies par immersion de la culture avec 30 ml de PBS + 0,05% de Tween-80. On filtre la suspension résultante à travers un tamis cellulaire de 40 um dans un tube de 50 ml pour éliminer les fragments d'hyphes. Centrifuge à 805 xg pendant 10 minutes, éliminer le surnageant et laver une fois dans 20 ml de PBS stérile. Piscine conidies de deux plaques de la même souche lors de l'étape de lavage. Après l'étape de lavage, resuspendre le culot dans 5 ml de PBS et le transfert aliquotes de 1 ml de suspension de conidies dans des tubes de microcentrifugation. 1 ml de suspension de chaque souche est généralement suffisant pour l'imagerie des cellules vivantes. Envelopper les aliquotes restantes dans la feuille et stocker à 4 ° C. aliquotes centrifugeuse de suspension de conidies à 9,300 g pendant 10 min à température ambiante et retirez soigneusement le surnageant. Remettre en suspension le culot dans 1 ml de conidies 0,05 M pH 8,3 NaHCO 3. Préparer 10 mg de biotine / 200 ul de diméthylsulfoxyde (DMSO) solution mère en reconstituant 25 mg de biotine dans 500 ul de DMSO. Ajouter 10 ul de biotine / DMSO solution mère dans le tube de microcentrifugeuse, le couvercle en feuille d'aluminium et incuber pendant 2 heures sur une bascule à 4 ° C. Aliquoter le reste de la biotine / DMSO stock solution et congeler à -20 ° C pour une utilisation dans des expériences ultérieures. Centrifuger pendant 10 min à 9,300 xg et retirez soigneusement le surnageant. Remettre en suspension le culot dans 1 ml de conidies de Tris-HCl pH 8,0 100 mM pendant 1 h pour désactiver la biotine flottante. Centrifuger pendant 10 min à 9,300 xg et retirez soigneusement le surnageant. Laver le culot deux fois avec 1 mL de PBS stérile et resuspendre le culot dans 1 ml de PBS. Dissoudre 1 mg de streptavidine-AF633 dans 0,5 ml de PBS pour faire une solution mère à 2 mg / mL. Ajouter 10 ul de 2 mg / ml de streptavidine-AF633 par 1 ml de suspension de conidies et incuber pendant 40 min à température ambiante sur une bascule recouverte de feuille d'aluminium. Le reste streptavidine-AF633 peut être congelé en aliquots pour une utilisation dans des expériences ultérieures. Centrifuger pendant 10 min à 9,300 xg et enlever soigneusement surnageant. Remettre en suspension le culot de conidies dans 1 mL de PBS et compter les conidies en utilisant un hémocytomètre à une dilution de 1: 1000 (1: 100 et 1:10). Ajuster la concentration de conidies à 3,6 x 10 6 / mL avec du CO 2 supports indépendants, envelopper dans du papier et stocker à 4 ° C. NOTE: Les conidies sont maintenant étiquetés avec AF633 et seront appelés FLARE conidies. Facultatif: Si la stimulation avec des conidies gonflé est nécessaire, après le comptage des conidies (étape 2.9), diluer conidies à 7,2 x 10 6 / ml dans une base d'azote de levure (YNB) moyen et ajouter 500 uL de suspension de conidies à 4,5 ml de milieu YNB dans un autoclave 50 ml flacon Erlenmeyer. Couvrir et placer le ballon dans un incubateur à secousses (200 tours par minute à 37 ° C) pendant 6 h. Transférer le milieu à un tube de 15 ml. Centrifuger à 805 g pendant 10 min à température ambiante et laver une fois dans du PBS. Centrifuger à nouveau culot et remettre en suspension dans 1 ml de milieu CO 2 indépendant, ce qui donne 3,6 x 10 6 conidies / ml. Remarque: Les conidies agglutiner fréquemment après enflent rendant difficile le comptage précis, il est conseillé de calculer le cnuméros ounted de repos conidies utilisés. 3. Isolement des humains neutrophiles et des monocytes Tracer 20 ml de sang veineux de volontaires sains dans deux tubes de sang de 10 ml contenant de l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA). Pour chaque donneur séparément, verser 20 ml de sang dans un tube de 50 mL et diluer avec 15 ml de PBS. Sous-couche du sang avec 15 ml d'une solution d'isolement des lymphocytes (densité 1,077 g / ml) avec une seringue et une aiguille de fer. Placer l'aiguille dans le bas du tube et forcer doucement la solution d'isolation de lymphocytes out. Centrifuger à 630 g pendant 20 min sans frein et une faible accélération. Préparer PBS, refroidi sur la glace. REMARQUE: Les étapes 3.4 et 3.5 doivent être suivies simultanément pour générer des monocytes (3.4) et neutrophiles (3,5). L'utilisation d'un pastette, récolte la couche PBMC. Ceci est la couche dans le centre entre la couche de sérum jaune (supérieure) et la solution d'isolation de lymphocytes transparent (inférieur), ettransférer dans un nouveau tube de 50 ml. Remplir le tube avec le PBMC jusqu'à 50 ml avec du PBS froid et centrifuger à 582 g pendant 10 min. Retirer le surnageant et laver deux fois avec du PBS froid et remettre en suspension dans 1 ml de PBS par 20 ml de sang de donneur utilisé initialement. Faire des dilutions 1:10 pour compter par addition de 20 ul de la suspension de cellules à 160 pi de PBS et 20 ul de bleu trypan. Compter les cellules avec un hémocytomètre. Préparer une solution tampon par addition de 26 ml de inactivé par la chaleur du sérum de veau fœtal (FCS) et 2,1 ml d'EDTA 0,5 M et 500 ml de HBSS. Centrifuger les cellules pendant 10 minutes à 515 xg et remettre en suspension dans 40 pl de solution tampon pour 1 x 10 7 cellules. Transférer la suspension cellulaire à un tube de 15 ml et ajouter 10 ul de microbilles CD14 par 1 x 10 7 cellules, bien mélanger et incuber pendant 15 min à 4 ° C, en veillant à mélanger les tubes toutes les 5 min. Laver les cellules en ajoutant 1 ml de solution tampon pour 1 x 10 7 cellules et centrifuge à 515 xg pendant 10 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension complètement jusqu'à 1 x 10 8 cellules dans 500 ul de solution tampon. Placer une colonne par échantillon sur un séparateur magnétique selon les instructions du fabricant. Tout d'abord laver la colonne une fois avec 500 pi de solution tampon. Pipeter 500 ul de suspension de cellules à travers la colonne, attendez la colonne pour sécher et laver, en répétant cette opération trois fois avec une solution tampon. Placer un nouveau tube de 15 ml en dessous de la colonne et prendre la colonne hors du séparateur magnétique. Ensuite, rincer les cellules de la colonne dans le tube avec 1 ml de solution tampon. Ajouter 4 ml de solution tampon et centrifuger à 515 g pendant 10 min, puis remettre en suspension dans 1 ml de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) de support. Faire des dilutions 1:10 pour compter par addition de 20 ul de la suspension de cellules à 160 pi de PBS et 20 ul de bleu trypan. Compter les cellules avec unhémocytomètre. Ajuster la concentration cellulaire à 6 x 10 5 / ml avec du RPMI et de semences de 200 ul sur une boîte de formation d'image à base de verre de 35 mm. Incuber pendant une nuit à 37 ° C avec 5% de CO 2. Le jour suivant, avant l'imagerie, retirer le RPMI et ajouter 200 ul de milieu CO 2 indépendant. Remarque: Ces monocytes peuvent également être différenciées en différents sous-ensembles macrophage avant l'imagerie. Si cela est une technique à explorer, un excellent point de départ est le document récent de Ohradanova-Repic et al. 1 1. Après la récolte, la couche PBMC, enlever tout le sérum et la majeure partie de la solution d'isolement des lymphocytes, mais attention à ne pas enlever la petite bande blanche sur le dessus de la pastille rouge comme cela contiendra la plupart des neutrophiles. Préparer un stock tampon de lyse hypotonique 10x en ajoutant 83 g de NH 4 Cl et 10 g de KHCO 3 dans 1 L d'eau stérile. Conserver à 4 °C. Diluez ce stock 10x avec de l'eau stérile et l'ajouter aux tubes. Ensuite, retourner avec précaution 3 fois et laisser incuber dans de la glace pendant 15 minutes. Centrifuger à 394 g pendant 10 min et remettre en suspension dans un tampon de lyse hypotonique pendant 10 min dans la glace. Centrifuger à 394 xg et laver deux fois avec du PBS froid. Remettre en suspension dans 1 ml de CO 2 par moyen indépendant donneur. Faire des dilutions 1:10 pour compter par addition de 20 ul de la suspension de cellules à 160 pi de PBS et 20 ul de bleu trypan. Compter les cellules avec un hémocytomètre. Par cytométrie de flux, d' ajuster la concentration de 6 x 10 5 / ml et ajouter la suspension de cellules 400 pl sur une plaque à 24 puits. Pour la microscopie, ajouter 200 pi de la même suspension de cellules dans une boîte de formation d'image à base de verre de 35 mm. Remarque: l' imagerie ou neutrophile cytométrie de flux doit être initié immédiatement en raison de leur propension à subir l' apoptose si on les laisse non stimulées. Si ce n'est pas possible neutrophiles doivent être conservésglace et utilisé le plus tôt possible (dans la même journée). 4. cytométrie en flux Ajouter 200 pi de 1,2 x 10 6 / mL FLARE conidies aux cellules dans la plaque à 24 puits, puis ajouter 100 ul de 20 ug / mL voriconazole. Ajouter 300 ul de RPMI et incuber pendant 16 h à 37 ° C avec 5% de CO 2. NOTE: Le voriconazole est ajouté pour empêcher la germination des conidies. Ajouter 25 ul d'une solution mère de calcofluor blanc 1 mM dans chaque puits pour une concentration finale de 25 uM et incuber pendant 10 min à 37 ° C avec 5% de CO 2. Centrifuger à 582 g pendant 10 min. Retirer le surnageant et laver deux fois avec du PBS. Pour récolter les cellules adhérentes (monocytes), ajouter 1 ml de PBS avec de l' EDTA 3 mM à chaque puits et incuber pendant 10 min à 37 ° C avec 5% de CO 2. Lavez délicatement les cellules de la plaque par pipetage et recueillir des cellules dans un tube. Laver une fois dans du tampon FACS (2% de sérum de veau foetal à PBS), puis remettre en suspension dans le tampon FACS pour l'analyse FACS. Pour l'analyse FACS, d'abord régler les paramètres de compensation du cytomètre à flux et régler les portes positifs en utilisant des tubes de compensation unique de couleur, y compris les conidies sans couleur: DsRed + conidies, AF633 + conidies, et calcofluor blanc + conidies (généré comme en 4.2). Set porte conidies libre basée sur l'avant et la diffusion latérale à l'aide conidies sans couleur. Régler la porte de la cellule sur l'avant et la diffusion latérale en excluant la porte de conidies libre. Analyse tube d'échantillon en enregistrant 10.000 événements. NOTE: Les cellules associées à conidies en direct seront DsRed + et + AF633. Les cellules associées aux conidies morts seront AF633 + seulement. Spectateur cellules qui n'ont pas engagés conidies sera dsRed- et AF633-. Les populations de cellules engagées conidies-sont analysés plus en détail pour calcofluor coloration blanc sur le canal bleu du Pacifique. Conidies qui restent en dehors des cellules sera calcofluor blanc + et conidies qui ont été intériorisé serontCalcofluor Blanc-. 5. Live Cell Microscopie Vidéo Remarque: Le choix du microscope dépendra de ce qui est disponible localement, mais la configuration du microscope devra inclure une étape inversée, une chambre environnementale chauffé à 37 ° C et les filtres d'excitation / émission appropriés pour DsRed (532/561 nm) et AF633 (633 nm). conidies FLARE ne fonctionnent pas avec le laser 488 nm au lieu du laser 532/561 nm pour DsRed. Lors de cette expérience pour cette première fois, utilisez le conidies de contrôle sans couleur et couleur unique pour tester la fluorescence de fond et transpercement entre les DsRed et les canaux de AF633. Mettre en marche le chauffe-microscope avant l'expérience et laisser suffisamment de temps pour la chambre de contrôle de l'environnement se réchauffer à 37 ° C. Le temps pris pour la température de la chambre afin de stabiliser varie pour différentes configurations de microscope. Allumez le microscope et l'ordinateur, et voiciannonce le logiciel d'imagerie. Monter le plat d'imagerie sur la scène du microscope et la mise au point de trouver les neutrophiles humains ou monocytes. Pour DsRed et AF633, régler la puissance du laser de 10% et le temps d'exposition à 1 s dans les paramètres d'acquisition. Retirer la lame de formation d'image et ajouter 100 ul de 3 x 10 6 / mL FLARE de suspension de conidies dans les puits appropriés (volume total de 300 pl / puits). Notez le temps que FLARE conidies sont ajoutés au plat. Retour à la diapositive la scène et régler la sensibilité de la caméra pour DsRed et AF633 pour voir clairement les conidies mais pas surexposer l'image. Mettre en place une liste de points d'étape si l'acquisition multi-points est nécessaire. Commencer l'imagerie lorsque tous les points sont mis au point, les canaux sont optimisés et le temps de cycle et la durée est définie. Le temps de cycle et la durée de formation d'image dépend de la question expérimentale. Le but est de maintenir le temps de cycle le plus court possible (≤2 min) avec 1 min pour permettre une analyse en profondeur de uptla dynamique de AKE.