組織特異的細胞培養および配信プラットフォームとして、細胞外マトリックス由来のフォームおよびマイクロキャリアの作製

1.脱細胞化組織処理脱細胞化および凍結乾燥確立されたプロトコルに従って、関心の脱細胞化組織（複数可）。 注：現在の研究で足場が人間のDAT 28、ブタDDT 8、およびブタDLV 32の公表脱細胞化プロトコルに従って作成されています。 50 mg / mlと – 市販の、不溶性コラーゲンはまた、10の濃度範囲にわたって成功裏に使用されたウシの腱から供給さコラーゲン発泡体およびマイクロキャリアを製造するために使用することができます。他の不溶性コラーゲン源が利用されてもよいが、安定した足場をもたらす濃度範囲を特定するために最適化を必要とするかもしれません。 鉗子で50mLの遠心管に水和脱細胞化組織または精製されたコラーゲンを移し、組織を沈めるために十分な蒸留水（のddH 2 O）を追加し、T35ミリリットルのOA最大総体積。 その後の凍結乾燥中の昇華のための表面積を最大にするために、凍結中水平に配置遠心管を、-80℃で一晩試料を凍結します。 遠心管のキャップを外し、凍結乾燥ジャーに凍結サンプルを移します。 72時間または完全に乾燥するまで – 48実験室用凍結乾燥機を使用してサンプルを凍結乾燥。 注記：乾燥時間が異なる凍結乾燥機および脱細胞化組織のために変化してもよいです。 鋭い外科用ハサミを使用して- （2 から3mm〜1）細かく小片に凍結乾燥されたECMをミンチ。 さらなる処理のための準備ができるまでデシケーター中にみじん切りECMを保管してください。 注：それはみじん切りECMは、環境からの水分の吸収を防ぐために、すぐに使用することをお勧めします。 低温ミリング（フォーム製造用のオプション） laborato 25 mLのステンレス鋼粉砕室を満たしますみじん切り凍結乾燥ECMとRYボールミルシステムと2個の10ミリメートルのステンレス鋼ミリングボールを追加します。 閉じると完全に3分間液体窒素にロードされた粉砕室を水没。 ミル30ヘルツ（1,800 rpm）で3分間凍結サンプル。 ECMは、微粉末に粉砕されるまで繰り返して、1.2.2と1.2.3を繰り返します。 注：これらの手順を繰り返す必要がある回数は、ECMソース間で異なる場合があります。例えば、DATは、典型的には、微粉末を生成するために、3つのミリングサイクルを必要とします。 ガラスバイアルに薬さじを用いた粉末を転送、しっかり密封し、デシケーター内で保存。 ECMの懸濁製剤 ECM（泡またはマイクロキャリアのため）のいずれか（フォーム用）ミンチ又はcryomilled 250mgのを秤量し、15mLの遠心分離管に移します。それぞれ、ミンチECMとcryomilled ECMの調製のための1.1.6及びセクション1.2ステップ参照。 注：このプロトコルは、50 mg / mlとECM suspenを準備するように設計されています、シオン人間DAT、ブタDDT、およびブタDLVのために推奨されています。特定ECM源に応じて、均一な懸濁液は、より高いまたはより低い出発濃度で生成することができます。 遠心管に緩衝液管上の液体レベルをマーク0.22 MのNaH 2 PO 4（pHは5.4）の5 mLを加え。 1 mLの0.22 MのNaH 2 PO 4（pHは5.4）緩衝液にαアミラーゼの7.5ミリグラムを添加することによってαアミラーゼのストック溶液を調製します。試料に、αアミラーゼストック溶液の100μL（w / wの乾燥組織の0.3％のαアミラーゼの0.75 mg）を加えます。 10 mLの最終容積を得るために、0.22 MのNaH 2 PO 4を加えます。 室温で72時間、300rpmで連続的に懸濁液を攪拌。 10分間1,500×gで懸濁液を遠心。慎重に収集し、消化ECMペレットを乱すことなく、上清を捨てます。 ddH 2 Oで希釈し、5％NaClを10mLのペレット化材料を再懸濁 ddH 2 O中の5％NaClで2回リンスの合計を繰り返しステップ1.3.5 上清を捨て、のddH 2 O 10mlにペレット化材料を再懸濁 RTで10分間、300rpmで連続的に懸濁液を攪拌。 10分間1,500×gで懸濁液を遠心。慎重に収集し、消化ECMペレットを乱すことなく、上清を捨てます。 ステップ1.3.2で行われた5 mLのマークに0.2M酢酸を加えます。 37℃で120 rpmでO / Nで連続懸濁液を攪拌します。 目に見える断片が残っていないまで、鋸歯幅10mmプローブを備えた手持ち式ホモジナイザーを用いて10秒間隔で、室温でECM懸濁液を均質化します。過熱を防ぐために、均質化間隔の冷水のビーカー中の懸濁液を置き。 注：ECMのソースに応じて、0.2 M酢酸でさらに希釈、均一な懸濁液を得るために必要とされ得ます。 EECM懸濁液xcessive冷却は、効率的な均質化を妨げる可能性が粘度の増加をもたらすことができます。粘度の増加が注目されている場合、サンプルは37℃まで再加温し、さらなる処理に供することができます。 最大1ヶ月前にフォームまたはマイクロキャリア製作に4°Cで保存。 2. ECM由来泡沫製作懸濁液が暖かくなるまで120rpmで連続攪拌しながら37℃でステップ1.3.13（みじん切りまたはcryomilled）からECM懸濁液をインキュベートします。 所望の濃度に酸性0.2 M酢酸でECM懸濁液を希釈します。 注：DAT、DDT及びDLVの推奨範囲としては50mg / mLの – – 15で、100 mg / mlとECMのソースに依存して、安定した発泡体は、10の範囲に調製することができます。一般的に、より高い濃度で作製した発泡体は、わずかに多孔性の低いが、文化の中でより安定で取り扱いが容易になります。 3 mLシリンジWを使用してECM懸濁液中の気泡の形成を防止するために、18 G針i番目、ECM懸濁液と所望の金型を充填します。 DAT、DDT、及びDLV発泡体を製造するために、48ウェル細胞培養処理プレートに35 mg / mlとECM懸濁液400μLを分注します。 注：選択された金型の形状とECM懸濁液の量は、得られる発泡体の形状を決定します。 カバーとCの冷凍庫°-20℃に置くか、-80で一晩金型を凍結すること。 注：凍結温度は、発泡体の気孔率に影響を与える可能性があります。 -80℃と比較して、サンプルが起因する大きな氷結晶33の形成に-20℃で凍結されたとき、より大きな孔が期待されています。均一な多孔質構造を有する発泡体を製造するために、金型は、指向冷却を防止するために、導電性表面に接触していないことを確認してください。 凍結乾燥フラスコに凍結サンプルを含む金型を置きます。 laboratに凍結乾燥フラスコを接続しますORY凍結乾燥機システム、24時間乾燥しました。 注：これは、サンプルは、凍結乾燥の前に凍結されたままであることが重要です。 必要になるまでデシケーター中で凍結乾燥した発泡体を保管してください。 エレクトロスプレーを介して、前記ECM由来のマイクロキャリアの作製注：セットアップエレクトロスプレーの概要は、図2に示されています。 100 rpmでO / Nで連続的に攪拌しながら37℃でステップ1.3.13からcryomilled ECM懸濁液をインキュベートします。 注：Cryomilled ECMは、懸濁液中のより高い均一性を確保し、エレクトロスプレー中に目詰まりを防止するために、ECM由来のマイクロキャリアを製造するために使用されます。 負荷を3mLルアーロック注射器にECM懸濁液の3mLのシリンジの内径上翼輸液セットを取り付けます。 注：ニードルゲージの範囲は、選択は、得られたマイクロキャリアのサイズおよび形状に影響を及ぼし得ることを認識し、使用することができます。 fabricatへE DAT、DDT、及びDLVマイクロキャリア、25 G針を使用します。 シリンジポンプ内に注射器を固定します。レトルトスタンドに針を固定し、4の距離で垂直に針の先端を位置決め – 低フォームデュワーフラスコの上部6センチ（250から500 mLのサイズ範囲を推奨します）。 針の先端にワニ口クリップ電極を取り付け、高圧電源の正端子に接続。 真空フラスコのエッジ上にアルミ箔（12×5センチ）のストリップを折り畳みます。 ホイルの外側縁部に第二ワニ口クリップ電極を取り付け、電源の接地ソース端子に接続。 箔の3/4浸漬されるように、頂部から約1cmまで液体窒素でデュワーフラスコを埋めます。 注：これは、液体窒素で満たされたデュワーフラスコを維持することが重要です。液体窒素の表面は、エレクトロスプレープロセスへ中にフラスコの上部からのNO 2以上cmでなければなりません秒。液体窒素の連続的な補充は、エレクトロスプレー中に一定レベルを維持するために必要とされます。 30ミリリットル/ hの注入速度にシリンジポンプを設定します。 注：注入速度は、マイクロキャリアの形状および直径を変更することができる変えることが、推奨範囲は25 – 35ミリリットル/時間。それは、懸濁液の粘度に大きく依存するが、25ミリリットル/時間以下の流量は、より大きなマイクロキャリアの生成をもたらし得ます。非常に低い流量では、マイクロキャリアの大きさや形状はあまり均質になることがあります。 35ミリリットル/ hの上記注入速度で、エレクトロスプレーを介して生成された液滴の均一性は、広いサイズ分布34を有する非球形マイクロキャリアをもたらす、破壊されてもよいです。 20キロボルトの電圧を印加し、エレクトロスプレーを開始するために、シリンジポンプをオンにします。 注：電圧を調整するためにマイクロキャリアのサイズを変えるとinfusioより径に大きな影響を有する傾向があることができますn個の割合。 25 kVの – 推奨される電圧範囲は15です。マイクロキャリア直径の減少は、電圧35の増加と予想されます。 注入が完了したら、慎重に、彼らは凍結のまま確保するために、液体窒素の〜25ミリリットルに懸濁し、マイクロキャリアを残して、デュワーから過剰な液体窒素をオフに注ぎます。 直ちに1つの滑らかな動きに注ぐことにより50mlの遠心管に液体窒素でマイクロキャリアを転送します。薬さじでデュワー内に残っている凍結されたマイクロキャリアを収集し、遠心管に追加します。 注：デュワーのサイズに応じて、液体窒素中でマイクロキャリアは、最初中型容器に注ぎ、次いで、50mLの遠心管に直ちに移すことができます。 凍結乾燥のための準備に小さな孔を穿孔アルミニウム箔で液体窒素中でマイクロキャリアを含む遠心管を覆います。 カバー遠心分離機を配置凍結乾燥フラスコにチューブ。直ちに凍結乾燥機にフラスコを接続し、サンプルO / Nを乾燥させます。 注：これは、解凍が崩壊および/または凝集をもたらすことができるよう、彼らは、このステップの前に解凍していないことを確認するために、液体窒素中に懸濁し、マイクロキャリアを維持することが非常に重要です。サイズが500ミクロン – 上記エレクトロスプレー条件を用いて35mgの/ mLの濃度で作製DAT、DDTとDLVマイクロキャリアは、典型的には、350の範囲の水和直径を有するであろう。サイズ分布は、ECMのソースに依存して変化し得ます。 必要になるまでデシケーター中で凍結乾燥されたマイクロキャリアを保管してください。 マイクロキャリアの製造に使用されるエレクトロスプレー装置の図2.概要。 ：シリンジポンプなどの主要エレクトロスプレー機器の配置を示す画像高電圧電源、並びに液体窒素のデュワーに対する針の位置。 B：電圧の推奨範囲を含む概略、注入速度、および距離をエレクトロスプレー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 細胞培養のため4.準備フォームおよびマイクロキャリア再水和 （：フォームエタノールの1比〜5）過剰の無水エタノール（〜99.9％）を含有する50mLの遠心管に鉗子で凍結乾燥された発泡体を移します。同様に、収集のために使用した元の遠心チューブ内に過剰の無水エタノール中で凍結乾燥マイクロキャリアを再懸濁。血清学的ピペットを使用して、任意の凝集物を除去し、所望のサイズ範囲を選択するために新しい50mlの遠心管に定義されたメッシュサイズを有するステンレスふるいを通してマイクロキャリアをフィルタリングします。注：フォームはTCPSプレート内に製造されている場合は、これらの容器内で直接再水和させることができます。 4時間またはフォームまたはマイクロキャリアまで4℃でインキュベート重力が遠心チューブの底に沈降しました。無菌試薬および適切な無菌技術を使用して、層流フード内のすべての後続のステップを実行します。 血清学的ピペットを使用して、無水エタノールを除去し、過剰の追加：足場に（5 1比）を滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で希釈し、95％エタノール。 4時間またはECM由来の足場は再水和容器の底に沈んするまで4℃でインキュベートします。 徐々に（滅菌PBSで希釈した90、85、80、75、70、50、25、0％）エタノールシリーズを通して足場を再水和します。足場は、溶液を変更する前に容器の底に沈んまで各ステップで、4℃でインキュベートします。足場内の気泡の形成がOBSある場合、光真空下で足場を脱気erved。 残留エタノールを除去するためにさらに2回のリンスのための滅菌PBSを交換してください。 細胞培養直前まで4°Cで100％の滅菌PBSで店舗。再水和、次の2週間 – 1以内に足場を使用してください。 細胞播種の準備播種の前の日に、細胞培養処理ウェルプレートまたはトランスウェルインサートに鉗子を使用してフォームを転送し、完全に足場（ 例えば、2.5ミリリットル/足場中に水没する（目的の細胞型に基づいて選択される）十分な細胞培養培地を追加12ウェルプレート）。マイクロキャリアへの媒体の1比：同様に、重力マイクロキャリアを慎重に、遠心分離管の中に沈降マイクロキャリアを乱すことなく血清学的ピペットを用いてPBSを除去し、及び5を達成するために、細胞培養培地を加えることを可能にします。 注：人間のASCを播種するために、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を利用：ハムF12栄養混合物を補っ10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン – ストレプトマイシン。 1回のすすぎの合計細胞培養培地を交換してください。 37℃で細胞培養培地中で一晩足場を平衡化。足場は翌日細胞播種のための準備が整います。 注：フォームは静的細胞培養インサートまたは組織培養ウェルプレート29中に播種し、または動的に実験室用振盪器36を用いて播種することができます。 ECM源、処理方法及びサスペンション濃度に応じて、動的播種初期細胞付着、増殖および浸潤を増強することができます。マイクロキャリアは、スピナー培養系11を使用して動的に播種することができます。