Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Anna Kornmuller; Cody F.C. Brown; Claire Yu; Lauren E. Flynn

doi:10.3791/55436

JoVE Journal > Bioengineering

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Bio-ingénierie

ייצור של תאי מטריקס הנגזרות קצפים Microcarriers כמו תרבית תאי רקמות ספציפיות פלטפורמות משלוח

Published: April 11, 2017

doi:

10.3791/55436

Anna Kornmuller¹, Cody F.C. Brown², Claire Yu³, Lauren E. Flynn^2,4

¹Biomedical Engineering Graduate Program,The University of Western Ontario, ²Department of Anatomy & Cell Biology, Schulich School of Medicine & Dentistry,The University of Western Ontario, ³Department of Chemical Engineering,Queen’s University, ⁴Department of Chemical & Biochemical Engineering, Faculty of Engineering,The University of Western Ontario

Summary

מטריקס רקמות ספציפיות (ECM) הוא מתווך המפתח תפקוד התא. מאמר זה מתאר שיטות סינתזת קצף טהור הנגזרות ECM ו- microcarriers כי הם יציבים בתרבות ללא צורך crosslinking כימי עבור יישומי 3D מתקדם במודלי תרבית תאים במבחנה או כפי bioscaffolds פרו-רגנרטיבית.

Abstract

תפקוד תא מתווך על ידי אינטראקציות עם תאי מטריקס (ECM), אשר יש רכב ואדריכלות רקמות ספציפיות מורכבים. ההתמקדות של מאמר זה היא על השיטות בודות קצף נקבובי הנגזרות ECM ו- microcarriers לשימוש כמו מצעים ביולוגיים-רלוונטיים 3D המתקדם במודלי תרבית תאים במבחנה או כמו פיגומים פרו-רגנרטיבית ומערכות אספקת התא עבור הנדסת רקמות ורפואת רגנרטיבית. שימוש ברקמות decellularized או קולגן מסיס מטוהרים כחומר מוצא, הטכניקות ניתן ליישם לסנתז מגוון רחב של bioscaffolds רקמות ספציפיות בגיאומטריות להתאמה אישית. הגישה כרוכה עיבוד מכני ועיכול אנזימטי מתון להניב ההשעיה ECM המשמש לפברק קצף תלת ממדי או microcarriers באמצעות הליכי הקפאה lyophilization נשלט. פיגומי ECM נגזרות טהורים אלה הם מאוד נקבוביים, עדיין יציבים ללא הצורך chemicאל crosslinking סוכנים או תוספים אחרים שעשויים להשפיע לרעה על תפקוד התא. מאפייני הפיגום יכולים להיות מכוונים במידה מסוימת על ידי גורמים שונים כגון ריכוז השעית ECM, שיטות עיבוד מכאניות, או תנאי סינתזה. באופן כללי, את הפיגומים הם חזקים וקלים לטפל, והוא יכול להיות מעובד כמו רקמות עבור רוב הבדיקות ביולוגיות סטנדרטיות, מתן פלטפורמת תרבית תאי 3D תכליתית וידידותי למשתמש המחקה את הרכב ECM ילידים. בסך הכל, שיטות פשוטות אלה עבור בודת קצף אישית נגזרות ECM ו- microcarriers עשויות להיות עניין שניהם הביולוגים והמהנדסים ביו כפלטפורמות רקמות ספציפיות תא-מאלף עבור במבחנה ביישומי vivo.

Introduction

מטריקס (ECM) מורכב רשת 3D מורכבת של חלבונים, גליקופרוטאינים, ורב-סוכרים ^1. שבעבר נחשב מסגרת מבנית בעיקר, זה עכשיו הוא מוכר היטב כי ECM משלבת מגוון רחב של מולקולות ביו עם תפקידים פונקציונליים חשובים ^2. אינטראקציות תא-ECM יכול לכוון תא הישרדות, הדבקה, הגירה, שגשוג, והבחנה ^3. בעוד המעמדות העיקריות של מקרומולקולות ECM הן בדרך כלל גם נשמרות לאורך רקמות ומינים, בכל רקמה יש רכב מטריקס ייחודי ואדריכלות ^4. בסך הכל, ECM רקמות ספציפיות מספקת microenvironment מאלפת שמתווך פונקציה מן התת-תאי סולם רקמות / איברים ^5.

בשל התפקיד המכריע של ECM בתיווך פונקציה הסלולר, יש כבר עניין גובר דהvelopment של bioscaffolds הנגזרות ECM עבור יישומים בהנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית. בפרט, השיטה של decellularization נחקרה בהרחבה כאמצעי להשגת ECM מתוך מגוון רחב של רקמות לשימוש כחומר פיגומים לשחזור רקמות תאי משלוח ^{^5,} ^{^6,} ^7. Decellularization בדרך כלל כולל סדרה של מכני, כימי, ו / או בשלבי טיפול ביולוגי ממוקד בהסרת תאים מרכיבים תאיים, תוך אידיאלי גרימת שינויים מינימליים למבנה 3D והרכב של ECM ^8. באמצעות מדידות בספרות, פרוטוקולי decellularization שונים ניתן לזהות כמעט לכל רקמה בגוף ^7.

בעוד רקמות decellularized ניתן להשתמש ישירות כמו פיגומים מושתלים או מצעי תרבית תאי 3D, חדירת הסלולר רשאיתיוגבל ברקמות עם מבנה ECM צפוף ^9. בהמשך, ההטרוגניות הטבעי ECM עלול לגרום השתנות מצורפות תא והפצה בתוך מטריצות decellularized, אשר עלול להשפיע על התגובה התאית ^10. בסך הכל, תוך שהם מבטיחים עבור יישומים מסוימים, החלים רקמות decellularized בצורתם השלמה מציע צדדי מוגבל מבחינת מאפייני פיגום הכוונון כולל צורה, נקבובי, וקשיחות, כמו גם את המצב המסירה עבור יישומי in vivo.

כדי לעקוף מגבלות אלו, קבוצות מחקר רבות מיישמות שיטות עיבוד נוספות ליצירת פורמטי פיגום אישית באמצעות רקמות decellularized כחומר בסיס. בצורה הפשוטה ביותר, זו עשויה להיות כרוכה cryomilling רקמות decellularized לייצר חלקיקי ECM רקמות ספציפיות להזרקת ^11. חלקיקי ECM אלה עשויים להיות משולבים כמו-ומכשירים סלולרייםרכיב ctive פיגומים מרוכבים עם חומרים ביולוגיים אחרים, כגון באתרו crosslinking הידרוג'ל ^{^12,} ^{^13,} ^14. בנוסף עיבוד מכני, רקמות decellularized יכול גם להיות נתון עיכול אנזימטי עם פרוטאוליטים ו / או אנזימים glycolytic לפברק הידרוג'ל הנגזרות ECM, קצף, microcarriers, וציפויים ^{^15,} ^{^16,} ^17, כמו גם לסנתז bioinks להדפסה 3D ^18.

בנוסף ליישומים הנדסיים-רקמה, bioscaffolds נגזרת ECM להחזיק פוטנציאל גדול עבור הדור של נאמנות גבוהה בדגמים במבחנה למחקר ביולוגי. קיים צורך משמעותי לפתח מערכות תרבית תאי 3D כי טוב לשחזר את המיקרו-סביבת הסלולר יליד ^19. רוב במבחנה גell מחקרים בתרבות עד כה נערכים בימי פוליסטירן בתרבית רקמה (TCPS), אשר יש קורלציה קטנה עם המילייה הסלולר המורכב ודינמי ביולוגיים נמצא בתוך רקמות חיות ^20. בעוד נוח לומד אינטראקציות הסלולר בתוך סביבה מבוקרת, culturing תא על מצעי 2D הנוקשים אלה פשוטות משנה מצורף תא ומורפולוגיה, כמו גם שני תאי תאים ותא-ECM קשרי גומלין ^{^21,} ^22. העיבודים הסלולר שנצפה על TCPS 2D יכול להשפיע מסלולי איתות תאיים המווסתים פונקציות תאים שונים כולל הישרדות, התפשטות, הגירה, והבחנה, מעלה שאלות לגבי מידת הרלוונטיות של מחקרים 2D ב דוגמנות במערכות vivo ^23. יש כבר הכרה גוברת כי התנהגות הסלולר יכול להשתנות במידה רבה 2D לעומת מערכות 3D ^24, וכי ביוכימיים דואיתות omechanical עם ECM הם מתווכים עיקריים של תא פונקציה ^25. קבוצות רבות ניסו להתגבר על המגבלות של מערכות 2D הוקמה על ידי ציפוי TCPS עם רכיבים ECM כגון קולגן, laminin, ו פיברונקטין. בעוד אסטרטגיות אלו יכולות לשפר מצורפות תא עשוי לשנות את תגובות הסלולר, מודלים אלה נשארים מוגבלים על ידי תצורת 2D שלהם כי לא לחקות את הארגון המרחבי המורכב או הביוכימיה של ECM ילידי ^{^26,} ^27.

המעבדה לביו-הנדסה שלנו כבר מתעניינים בפיתוח של bioscaffolds הנגזרות ECM כמו מצעים עבור יישומים תרבית תאים 3-D ורקמות-הנדסה. בפרט, יש לנו חלוץ השימוש ברקמה שומנית decellularized (DAT) כפלטפורמת פיגומים להתחדשות שומנית ^28. יתר על כן, הקמנו שיטות סינתזה microcarriers 3D קצף נקבובי באמצעות DAT מתעכל עם פפסין אנזים פרוטאוליטי או אנזים glycolytic α-עמילאז ^{^29,} ^{^30,} ^31. יש לציין, שהראנו בכל פורמטי פיגום אלה כי ECM הנגזרות השומן מספק במיקרו-סביבה אינדוקטיביים עבור בידול adipogenic של תאי גזע / סטרומה הנגזרות השומן האנושי (ASCs) בתרבות. לאחרונה, הרחבנו שיטות הייצור שלנו כדי ליצור קצף נקבובי 3D מ חזירי-מתעכל-עמילאז α decellularized החדר השמאלי (DLV) (שיטות decellularization מותאמת ויינרייט et al. ^32), והראה כי הם מספקים פלטפורמה תומכת גרימת cardiomyogenic מוקדם ביטוי סמן ב ASCs נגזר שומן אנושי קרום הלב ^31.

מאמר זה מתאר בפירוט את שיטות סינתזה כימית הלא קצפי microcarriers נקבוביים 3D צולבים נבעו משיקוליםמ ECM-עמילאז מתעכל α לשימוש 3D המורכב ביולוגי מצעי תרבית תאים במבחנה וכפי biomaterials לשחזור רקמות. בתיאוריה, כל מקור ECM המכיל קולגן משקל מולקולרי גבוה עשוי לשמש כחומר מוצא את הטכניקות הללו. כדי להדגים את הגמישות של גישה זו, השיטות יושמו ליצור bioscaffolds רקמות ספציפיות באמצעות אדם DAT, רקמות עורי decellularized חזירי (DDT) ^8, ו חזירי DLV כדוגמאות נציג. איור 1 מספק סקירה ויזואלית של תהליך הייצור עבור קצף נגזרות ECM ו- microcarriers.

איור 1. סקירה כללית של השיטה לייצור של קצף הרקמות ספציפי נגזרות ECM ו- Microcarriers. 1. רקמות decellularized, הוכנו לאחר שהוקמה decelפרוטוקולים lularization, ניתן להשתמש עבור ייצור bioscaffold רקמות ספציפיות הנגזרות ECM. תמונות מאקרוסקופיים מוצגים של DAT האדם hydrated (מוכן כמתואר פלין 2010 ^28), DDT חזירי (מוכן כמתואר Reing, JE, et al. 2010 ^8), ו DLV חזירי (מוכן כמתואר ויינרייט et al. 2010 ³² ניתן להשתמש), כדוגמאות של מקורות ECM כי נציג כחומרי מוצא. ברי סולם מייצגים 3 סנטימטר. 2. רקמות decellularized הם lyophilized, ולאחר מכן 3. טחון מכנית. ברי סולם מייצגי 1 סנטימטר. 4. ECM טחון לאחר מכן ניתן cryomilled, אשר הוא אופציונלי עבור ייצור קצף, אך נדרש עבור סינתזה microcarrier. בר סולם מייצג 3 מ"מ. 5. ECM הטחון או cryomilled אז מתעכל עם α-עמילאז הומוגני ליצור השעית ECM הומוגנית. בר סולם מייצג 1 ס"מ. <strאונג> 6 א) עבור ייצור קצף, השעית ECM מועבר לתוך lyophilized המוגדר על ידי המשתמש עובש, קפוא, וכדי ליצור פיגום 3D נקבובי עם גיאומטריה מוגדרת היטב. בר סולם מייצג 1 ס"מ. 6b) עבור ייצור microcarrier, השעית ECM cryomilled היא electrosprayed ליצור microcarriers הכדורי דיסקרטי. בר סולם מייצג 2 מ"מ. 7. קצפי microcarriers לאחר מכן ניתן rehydrated בהדרגה זורע עם תאים. תמונות מייצגות מוצגות של ASCs האנושי (תאי קיימא = ירוק) זורעות על קצף DAT (משמאל) microcarrier DAT (מימין). ברי סולם מייצגים 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Protocol

1. עיבוד רקמות decellularized Decellularization ו Lyophilization Decellularize רקמות (ים) של עניין בעקבות פרוטוקול הוקם. הערה: פיגומים במחקר הנוכחי נערכו באי פרוטוקולי decellularization שפורסמו עבור האדם DAT 28, DDT החזירי 8, ו החזירי DLV 32. זמין מסחרית, קולגן מסיס יכול לשמש גם כדי לפברק קצפים microcarriers, כגון קולגן שמקורו מן גיד שור, אשר שימש בהצלחה על פני טווח הריכוז של 10 – 50 מ"ג / מ"ל. מקורות קולגן מסיסים אחרים עשויים להיות מנוצלים, אך עשוי לדרוש אופטימיזציה כדי לזהות את טווח הריכוז שיניב פיגומים יציבים. העברת רקמה hydrated decellularized או קולגן מטוהרים לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ"ל עם מלקחיים ולהוסיף מים מזוקקים פעמיים מספיק (DDH 2 O) כדי להטביע את הרקמה, tOA נפח כולל מרבי של 35 מיליליטר. להקפיא מדגם לילה בשעת -80 ° C, עם צינור צנטריפוגות הממוקם אופקי במהלך הקפאה על מנת למקסם את שטח הפנים סובלימציה במהלך lyophilization לאחר מכן. הסר את המכסה מהצינור צנטריפוגות ולהעביר את המדגם קפוא לתוך צנצנת lyophilization. Lyophilize המדגם בעזרת מייבש הקפאה במעבדה במשך 48 – 72 שעות או עד שהן מתייבשות לגמרי. הערה: זמן הייבוש עשוי להשתנות עבור lyophilizers שונים ורקמות decellularized. דק לרכך את ECM lyophilized לחתיכות קטנות (~ 1 – 2 מ"מ 3) באמצעות מספרי כירורגיים חדים. אחסן את ECM טחון ייבוש עד מוכן להמשך עיבוד. הערה: מומלץ כי ECM טחון לשמש מיד כדי למנוע ספיגת לחות מהסביבה. Cryomilling (אופציונלי עבור ייצור קצף) מלאו בתא טחינה נירוסטה 25 מ"ל עבור laboratoמערכת טחנת כדור ר"י עם ECM lyophilized טחון ולהוסיף שני 10 מ"מ כדורי טחינה מפלדת אל-חלד. סגור להטביע את תא טחינה טעון לגמרי בחנקן נוזלי עבור 3 דקות. מיל המדגם הקפוא במשך 3 דקות ב 30 הרץ (1800 סל"ד). חזור על שלבים 1.2.2 ו 1.2.3 עד ECM מחורץ לאבקה דקה. הערה: מספר הפעמים השלבים הבאים יש לחזור עשוי להשתנות בין מקורות ECM. לדוגמה, DAT בדרך כלל דורש 3 מחזורים טחינה ליצור אבקה דקה. מעביר את האבקה באמצעות scoopula לתוך בקבוקון זכוכית, לאטום היטב, ולאחסן ייבוש. הכנת השעית ECM תשקלי 250 מ"ג או טחון (קצף) או cryomilled (קצף או microcarriers) ECM ולהעביר אותו צינור צנטריפוגות 15 מ"ל. עיין לשלב 1.1.6 וסעיף 1.2 עבור הכנת ECM טחון ו ECM cryomilled, בהתאמה. הערה: פרוטוקול זה נועד להכין 50 מ"ג / מ"ל ECM suspenשיאון, אשר מומלץ עבור DAT האנושי, DDT חזירי, ו חזירי DLV. בהתאם למקור ECM הספציפי, השעיות אחידות עלולות להיוצר בריכוזים מוצאים גבוהים או נמוכים. מוסיפים 5 מ"ל של 0.22 M לאא 2 PO 4 (pH 5.4) חיץ צינור צנטריפוגות ולסמן את רמת הנוזל על הצינור. הכן פתרון המניות α-עמילאז על ידי הוספת 7.5 מ"ג של עמילאז α ל 1 מ"ל 0.22 M לאא 2 PO 4 (pH 5.4) חיץ. הוספת 100 μL של פתרון מניות עמילאז α (0.75 מ"ג של עמילאז α; 0.3% w / w של רקמות יבשות) המדגם. מוסיפים 0.22 M לאא 2 PO 4 להשיג נפח סופי של 10 מ"ל. להתסיס את ההשעיה ברציפות ב 300 סל"ד במשך 72 שעות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה ההשעיה ב 1500 XG במשך 10 דקות. בזהירות לאסוף וזורקים supernatant מבלי להפריע גלולה ECM מתעכל. Resuspend החומר pelleted ב 10 מ"ל של 5% NaCl מדולל ב DDH 2 O. חזור על שלב 1.3.5 עבור סכום כולל של שתי שטיפות עם 5% NaCl ב DDH 2 O. בטל supernatant מחדש להשעות את החומר pelleted ב 10 מ"ל של DDH 2 O. להתסיס את ההשעיה ברציפות ב 300 סל"ד במשך 10 דקות ב RT. צנטריפוגה ההשעיה ב 1500 XG במשך 10 דקות. בזהירות לאסוף וזורקים supernatant מבלי להפריע גלולה ECM מתעכל. הוספת 0.2 M חומצה אצטית לסימן 5 מ"ל עשה צעד 1.3.2. להתסיס את ההשעיה ברציפות ב 120 סל"ד O / N ב 37 מעלות צלזיוס. Homogenize השעית ECM בטמפרטורת חדר במרווחים של עשר שניות באמצעות homogenizer כף יד מצויד חללית רחבה במסור שן 10 מ"מימ עד שלא נותרים שברים גלויים. מניחים את ההשעיה בכוס מים קרים בין מרווחי הומוגניזציה כדי למנוע התחממות יתר. הערה: בהתאם למקור ECM, דילול נוסף 0.2 M חומצה אצטית עשויים להידרש לקבל השעיה הומוגנית. Eקירור xcessive השעית ECM עלול לגרום לעלייה צמיגה שיכול להפריע הומוגניזציה יעיל. אם גידול צמיגות יצוין, המדגם ניתן rewarmed כדי 37 מעלות צלזיוס ו נתון עיבוד נוסף. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש לפני קצף או המצאה microcarrier. 2. ייצור קצף נגזרות ECM לדגור על השעיית ECM משלב 1.3.13 (טחון או cryomilled) בשעה 37 ° C עם תסיסה מתמשכת ב- 120 סל"ד עד ההשעיה היא חמה. לדלל את ההשעיה ECM ב 0.2 M אצטית חומצי לריכוז הרצוי. הערה: בהתאם למקור ECM, קצף יציב עשוי להיות מוכן בטווח של 10 – 100 מ"ג / מ"ל, עם 15 – 50 מ"ג / מ"ל כפי הטווח המומלץ עבור DAT, DDT ו- DLV. בדרך כלל, הקצף המפוברק בריכוזים גבוהים יותר יהיה מעט פחות נקבובי אבל יותר יציב בתרבות קלה יותר להתמודד. באמצעות מזרק מ"ל 3 wה- i מחט 18 G כדי למנוע היווצרות בועת השעית ECM, למלא את התבנית הרצויה עם השעית ECM. לפברק את DAT, DDT, קצף DLV, לוותר 400 μL של 35 מ"ג / מ"ל ההשעיה ECM לתוך צלחת תרבות שטופלו 48-היטב בתא. הערה: צורת התבנית שנבחרה והיקף ההשעיה ECM יקבע את הגיאומטריה של קצף כתוצאה. מכסים וממשיכים להקפיא את תבניות לילה על ידי הצבתם -20 ° C או -80 ° C במקפיא. הערה: את טמפרטורת הקיפאון עלולה להשפיע על נקבוביות של הקצף. גדול הנקבוביות צפויים כאשר דגימות קפואות ב -20 מעלות צלזיוס לעומת -80 מעלות צלזיוס בשל היווצרות של גבישי קרח גדולים 33. לפברק קצף עם מבנה אחיד נקבובי, להבטיח כי העובש הוא לא במגע עם משטח מוליך כדי למנוע קירור כיוונית. מניח את התבניות המכילות דגימות הקפואות לתוך בקבוק lyophilizer. חברו את הבקבוק lyophilizer אל Laboratמערכת מייבש הקפאת העור ויבשה עבור 24 h. הערה: חשוב כי המדגם נשאר קפוא לפני lyophilization. אחסן את קצף lyophilized ייבוש עד הנדרשת. 3. נגזרות ECM ייצור microcarrier באמצעות Electrospraying הערה: סקירה של electrospraying להגדיר מוצגת באיור 2. לדגור על השעיית ECM cryomilled משלב 1.3.13 בשעה 37 ° C עם תסיסה מתמשכת ב- 100 סל"ד O / N. הערה: Cryomilled ECM משמש לפברק את microcarriers נגזרת ECM כדי להבטיח אחידות רבה יותר ההשעיה ולמנוע סתימה במהלך electrospraying. טען 3 מ"ל של השעיה ECM לתוך מזרק מנעול 3 מ"ל Luer ולצרף עירוי מכונף להגדיר על נשא של מזרק. הערה: טווח של מחטי המחוונים ניתן להשתמש, מתוך הכרה כי הבחירה עשויה להשפיע על הגודל והצורה של microcarriers כתוצאה. כדי fabricate את DAT, DDT, ו microcarriers DLV, להשתמש במחט G 25. אבטח את המזרק בתוך משאבת מזרק. הדק את המחט אל דוכן היענות עמדת קצה המחט בצורה אנכית במרחק של 4 – 6 סנטימטר מהחלק העליון של בקבוק דיואר נמוך טופס (250 – 500 טווח גודל מיליליטר מומלץ). צרף ואלקטרודה קליפ תנין אל קצה המחט ולחבר אותו אל הקוטב החיובי של אספקת החשמל במתח גבוה. מקפלים רצועה של נייר אלומיניום (12 x 5 ס"מ) מעבר לקצה את תרמוס. צרף אלקטרודה קליפ תנין השני אל הקצה החיצוני של רדיד ולחבר אותו למסוף מקור הקרקע של אספקת החשמל. למלא את הבקבוק דיואר עם חנקן נוזלי כ 1 ס"מ מהחלק העליון, כך ¾ של רדיד הוא שקוע. הערה: חשוב לשמור את הבקבוק דיואר מלאים בחנקן נוזלי. פני השטח של חנקן נוזלי חייב להיות לא פחות מ 2 ס"מ מהחלק העליון של הבקבוק במהלך למחזור electrosprayingים. מילוי רציף של החנקן הנוזלי נדרש לשמור על רמה קבועה במהלך electrospraying. הגדר את משאבת מזרק כדי שיעור עירוי של 30 מ"ל / h. הערה: משנים את קצב העירוי יכול לשנות את הצורה microcarrier ואת קוטר, אבל בטווח המומלץ הוא 25 – 35 מ"ל / h. אמנם זה תלוי מאוד את הצמיגות של ההשעיה, ספיקות מתחת 25 מיליליטר / h עלולות לגרום לדור של microcarriers הגדול. ברמות ספיקה נמוכה מאוד, בגודל ובצורה של microcarriers עשוי להיות פחות הומוגנית. בשיעורים עירוי מעל 35 מ"ל / h, את האחידות של טיפות שנוצר באמצעות electrospraying עשויה להיות מופרת, וכתוצאה מכך microcarriers הלא-כדורית עם התפלגות גודל רחב יותר 34. החלת מתח של 20 קילו ולהדליק את משאבת מזרק ליזום electrospraying. הערה: המתח עשוי להיות מגוון כדי לכוון את גודל microcarriers ונוטה להיות בעל השפעה גדולה יותר על הקוטר מאשר infusioשיעור n. טווח המתח המומלץ הוא 15 – 25 קילו. ירידה בקוטר microcarrier צפויה עם עליית מתח 35. לאחר העירוי הושלם, בזהירות לשפוך את חנקן נוזל עודף דיואר, עוזב את microcarriers מושעה ב ~ 25 מיליליטר של חנקן נוזלי כדי להבטיח שהם יישארו קפוא. מיד להעביר את microcarriers עם חנקן נוזלי לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ"ל ידי שפיכת בתנועה אחת חלקה. אסוף כל microcarriers קפוא שנותרו דיואר עם scoopula ולהוסיף אותם בצינור צנטריפוגות. הערה: בהתאם לגודל של דיואר, את microcarriers בחנקן נוזלי יכול להיות בתחילה נשפך לתוך כלים ובינוניים, ולאחר מכן הועבר מייד לתוך צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר. מכסה את צינור צנטריפוגה המכיל את microcarriers בחנקן נוזלי עם רדיד אלומיניום מחורר עם חורים קטנים לקראת lyophilization. מניח את צנטריפוגה המכוסיתצינורות לתוך בקבוק lyophilizer. מיד לחבר את הבקבוק אל lyophilizer ולייבש את הדוגמאות O / N. הערה: חשוב מאוד לשמור על microcarriers מושעה בחנקן נוזלי כדי להבטיח שהם לא להפשיר לפני שלב זה, כמו הפשרה עלולה לגרום להתמוטטות ו / או צבירה. microcarriers DAT, DDT ו- DLV מפוברק בריכוז של 35 מ"ג / מ"ל באמצעות תנאים electrospraying שתוארו לעיל יהיו בדרך כלל בקוטר שנע בין 350 hydrated – 500 מיקרומטר בגודל. התפלגות הגודל עשויה להשתנות בהתאם למקור ECM. אחסן את microcarriers lyophilized ייבוש עד הנדרשת. איור 2. סקירה כללית של מכשיר Electrospraying המשמש ייצור microcarrier. ת: תמונה המציגה את הסדר של ציוד electrospraying המרכזי, לרבות משאבת המזרקאספקת חשמל גבוה מתח, כמו גם את המיצוב של יחסי המחט אל דיואר של חנקן נוזלי. B: Electrospraying סכמטי, לרבות הטווחים המומלצים עבור המתח, עירוי שיעור, ומרחק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. 4. קצפים Microcarriers הכנות לקראת תרבית תאים rehydration מעבירים את קצף lyophilized עם מלקחיים לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ"ל המכיל אתנול אבסולוטי עודף (~ 99.9%) (~ 5: 1 יחס של אתנול תוספת קצף). באופן דומה, להשעות את microcarriers lyophilized באתנול המוחלט העודף בתוך צינור צנטריפוגות המקורי המשמש לאיסוף. בעזרת פיפטה סרולוגיות, לסנן את microcarriers דרך מסננת נירוסטה עם גודל רשת מוגדר לתוך צינור 50 מ"ל צנטריפוגות חדשות כדי להסיר כל אגרגטים ובחר טווחי הגודל הרצוי. הערה: אם הקצף מיוצר בתוך צלחות TCPS, הם יכולים להיות rehydrated ישירות בתוך הכלים האלה. לדגור על 4 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות או עד שיש קצף או microcarriers הכבידה התיישבו אל החלק התחתון של הצינור צנטריפוגה. ביצוע כל הצעדים הבאים ברדס זרימה למינרית באמצעות ריאגנטים סטרילי טכניקה מזוהמת נכונה. הסר את אתנול אבסולוטי בעזרת פיפטה סרולוגיות ולהוסיף עודף (5: יחס 1) 95% אתנול מדולל עם בופר פוספט סטרילית (PBS) כדי הפיגומים. לדגור על 4 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות או עד הפיגומים נגזרים ECM שקעו אל קרקעית כלי ההתייבשות. בהדרגה רעננותם הפיגומים באמצעות סדרת אתנול (90, 85, 80, 75, 70, 50, 25 ו 0%, בדילול עם PBS סטרילי). בכל שלב, דגירה על 4 מעלות צלזיוס עד הפיגומים שקעו אל קרקעית הכלי לפני שינוי הפתרון. דגת הפיגומים תחת ואקום אור אם היווצרות בועה בתוך הפיגומים היא OBServed. החלף את PBS סטרילי עבור שתי שטיפות נוספות כדי להסיר אתנול שיורית. חנות ב 100% PBS סטרילי ב 4 מעלות צלזיוס עד מוכן תרבית תאים. השתמש פיגומים בתוך 1 – 2 שבועות בעקבות התייבשות. הכנה זריעת תאים ביום שלפני זריעה, להעביר את קצף באמצעות מלקחיים לתוך תרבית תאים שטופלו היטב צלחות או מוסיף transwell ולהוסיף תרבית תאים בינוניים מספיק (שנבחרו בהתאם לסוג עניינים התא) כדי להטביע את הפיגומים לחלוטין (למשל, 2.5 מ"ל / הפיגום צלחת 12-היטב). בדומה לכך, לאפשר microcarriers הכבידה ליישב בתוך צינור צנטריפוגות, ובזהירות להסיר את PBS בעזרת פיפטה סרולוגיות מבלי להפריע microcarriers, ולהוסיף תרבית תאים בינוניים להשיג 5: יחס 1 של המדיום אל microcarriers. הערה: זריעת ASCs האנושית, לנצל בינוני של הנשר Modified של Dulbecco (DMEM): תערובת מזין F12 של חם בתוספת10% בסרום שור העובר (FBS) ו 1%, סטרפטומיצין פניצילין. החלף את תרבית תאים בינוניים בהיקף כולל של שטיפה אחת. לאזן את לילה פיגומי תרבית תאים בינוני ב 37 מעלות צלזיוס. הפיגומים יהיו מוכנים תא זריעה למחרת. הערה: קצף ניתן זורעים סטטי מוסיף תרבית תאים או צלחות גם בתרבית רקמה 29, או דינמי זורעים באמצעות שייקר מעבדה 36. בהתאם למקור ECM, שיטות עיבוד וריכוז השעיה, זריעה דינמית עלולה להגביר מצורף, התפשטות וחדירת תא ראשוני. Microcarriers ניתן זורעים דינמיים באמצעות מערכת תרבות טווה 11.

Representative Results

במחקר הנוכחי, יש לנו מפוברק קצף ECM הנגזרות microcarriers באמצעות DAT האנושי, DDT חזירי, ו חזירי DLV כדוגמאות נציג הוכחת כי טכניקות ניתן ליישם על מנת ליצור bioscaffolds רקמות ספציפיות תוך שימוש במגוון של רקמות decellularized כמקורות ECM ( איור 1). עבור שניהם ייצור קצף microcarrier, הטכניקה Nishihara של solubilization קולגן עם האנזים glycolytic α-עמילאז 37 הותאם כדי ליצור ההשעיה ECM צמיגה מהחומרים decellularized החל רקמות, אשר משמש כדי לסנתז את bioscaffolds באמצעות הליכי הקפאה lyophilization נשלט. לפברק קצף, רקמות decellularized יכול להיות מעובד או באמצעות מִצטַעֲצֵעַ מכני או cryomilling כדי להגדיל את שטח הפנים לפני עיכול אנזימטי. הבא45; -amylase טיפול ויצירת הומוגניות, השעית ECM כתוצאה הוא חלקה לתוך תבנית מוגדרת משתמש, אשר אז קפוא ו lyophilized. הפיגומים ניתן לאחסן ביציבות במצב יבש במשך תקופה ארוכה של זמן. לפני השימוש במחקרי תרבית תאים, פיגומי lyophilized חייבים להיות נתונים תהליך התייבשות מבוקר כי תשואות נקבובי מאוד-hydrated קצף הומוגנית נגזר ECM הטהור (איור 3A). אם קצף הם rehydrated מהר מדי, נפיחות מהירה עלולה לגרום נזק תכונות מבניות עדין, וכתוצאה מכך אובדן של יושר התמוטטות מבנית. באופן כללי, הקצף יישמר על הצורה שהוגדרה על ידי ההתייבשות הבאה העובש המקורי יציבים ללא צורך crosslinking כימי. איור 3B מציג מיקרוסקופ אלקטרונים סורק נציג תמונות (SEM) של DAT, DDT, ו DLV קצף מפוברק עם ECM cryomilled בריכוז של 35 מ"ג / מ"ל ו טמפרטורת הקיפאון של -80 & #176; ג. איור 3. תמונות נציג של DAT, DDT, ו DLV קצף מפוברק עם Cryomilled ECM השעיות בריכוז של 35 מ"ג / מ"ל ו קפוא ב -80 מעלות צלזיוס. ת: נוף מאקרוסקופית של DAT, DDT, ו DLV הסתובבו קצף מסונתז עובש צלחת בתרבית רקמה 48-היטב הבאים התייבשות. ברי סולם מייצגי 1 סנטימטר. B: תמונות SEM של DAT, DDT, קצף DLV מראה ultrastructure נקבובי הומוגנית. ברי סולם מייצגים 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. מתלי ECM cryomilled יכולים לשמש גם כדי ליצור microcarriers ECM נגזרות טהור באמצעות טכניקות electrospraying (איור 2 </strאונג>). עבור כל מקור ECM, ריכוז ההשעיה, מחט מד, קצב עירוי, ואת המתח יכול להיות מכוון לייצר microcarriers כדורית דיסקרטית החל 350 – 500 מיקרומטר בקוטר הבאים התייבשות מבוקרת (איור 4A). בעוד microcarriers ניתן לאחסן במצב lyophilized, מומלץ על מנת להקל על טיפול שהם ויתרו או מסתננים למגוון לגודל רצוי הבא resuspension באתנול. הדמיה SEM מרמזת כי ultrastructure microcarrier יכול להשתנות בהתאם למקור הרקמה decellularized (איור 4 ב). איור 4. תמונות נציג של DAT, DDT, ו DLV Microcarriers מפוברק עם Cryomilled ECM השעיות בריכוז של 35 מ"ג / מ"ל, שיעור עירוי של 0.5 מ"ל / דקה, וכן מתח יישומית של 20 קילו. ת: o נוף מאקרוסקופיים.ו microcarriers DAT, DDT, ו DLV hydrated. ברי סולם מייצגים 4 מ"מ. B: תמונות SEM של DAT, DDT, ו microcarriers DLV מראה כי ultrastructure וגודל יכול להשתנות בהתאם למקור ECM. ברי סולם מייצגים 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. התכונות המכאניות של הפיגומים תלויות מקור ECM, שיטת העיבוד מיושמת (כלומר מיותרת מול cryomilling), ריכוז השעית ECM, ואת טמפרטורת הקיפאון. באופן כללי, את הפיגומים הם רכה וכנועה, עם moduli של יאנג בטווח של 1 – 5 kPa דיווחו על DAT (50 & 100 מ"ג / מ"ל) 29 ו קצף DLV (20 – 50 מ"ג / מ"ל) 31, ו <1 kPa עבור microcarriers. קצף cryomilled הם בדרך כלל רך הקצף הטחון בשל האופי שיבשו יותר שלהם. מערכות לבדיקות מכאניות Specialized מצוידות בתאי עומס מאוד רגישים נדרשות עבור אפיון מדויק של מאפייני הדחיסה. בדרך כלל, קצפי microcarriers יצטרכו moduli נמוך רקמות decellularized יליד בשל צעדי עיבוד הנוספים המעורבים ייצור כולל עיכול ויצירת הומוגניות אנזימטי, כמו גם את האופי הלא-קוולנטית הצולבים של הפיגומים. עם זאת, זה יכול להשתנות בהתאם הרקמה של עניין. לדוגמה, בעבודה הקודמת, מצאנו כי טחון DAT קצף מפוברק בריכוזים גבוהים ECM (100 מ"ג / מ"ל) היו moduli דומה רקמת שומן ילידי 29. קצף ECM נגזרת rehydrated ו microcarriers ניתן זורע עם תאים בתנאי תרבות סטטי או דינמיים לספק פלטפורמה תומכת תא ללימודי תרבות תאים במבחנה ב ו / or במשלוח תא vivo. בעוד הפיגומים בדרך כלל לתמוך מצורף תא, את יעילות הזריעה תהיה תלויה מקור ECM, גיאומטרית הפיגום הנקבובי, ואת סוג התא של עניין. ככזה, שיטות וצפיפות הזריעה תדרושנה אופטימיזציה בהתאם לתנאים המוגדרים על ידי המשתמש. לקבלת קצף שתוארו לעיל, אנו ממליצים על ריכוז תאי המוצא בטווח של 0.25 – 1 x 10 6 תאים / הפיגום, עם זריעה דינמית על שייקר מסלולית כדי לשפר חדירה לתא. עבור microcarriers, אנו מציעים צפיפות זריעה ראשונית בטווח של 25,000 – 50,000 תאים / מ"ג microcarriers, עם זריעה להתבצע בתנאים דינאמיים בבקבוק התרבות טווה 11. התמונות הראו בתחתית איור 1 לייצג ASCs האדם זורעים על קצף DAT (משמאל) או DAT microcarrier (מימין, prelabeled עם צבע אמין-reactive והופעה כחול 13), דמיינו כפי מיקרו confocalscopy באמצעות כתם כדאי תא פלורסנט (תאי חיים = ירוקים, תאים מתים = אדום; ברי סולם מייצגים 100 מיקרומטר). מיקרוסקופיה Confocal יכולה לשמש כדי לחזות תאים שנזרעו על פני השטח של קצף עד 2 מ"מ עובי, אבל להדמיה לתוך האזורים המרכזיים של הפיגומים מוגבלות מטבעה האטום שלהם. עם זאת, קצפי microcarriers יכולים להתייחס אליהם כאל רקמות פרפין-מוטבע או קריו-נותח במשך היסטולוגית אימונוהיסטוכימיים מנתח לדמיין חלוקת תא ביטוי סמן.

Discussion

באופן כללי, bioscaffolds נגזר רקמות decellularized יכול יותר מקרוב בקירוב את רכב 3D מורכב במבנה של ECM ב במייקרו-הסביבה הסלולרית מהקורה לעומת פיגומים סינטטיים או מודלי תרבות סטנדרטיים מבוססים על 2D TCPS. כפי שנאמר קודם לכן, אינטראקציות תא-ECM חשובים באופן קריטי בתיווך התנהגות הסלולר הן בתרבות בגוף ^1. מתוך הכרה כי התכונות הביוכימיות, ביופיסיקליים, ו ביומכנית של ECM הן ייחודיות לכל רקמה, יש להגדיל ראיות לתמוך את הרציונל ליישום גישות ספציפיות-רקמות בעיצוב של חומרים ביולוגיים עבור הנדסת רקמות, כמו גם בפיתוח של יותר מבחינת פיזיולוגית מודלי תרבות רלוונטית עבור ניסויים במבחנה ב ^20. ניצול רקמות decellularized כחומר החל, שיטות שלנו יכול לשלב את יצירתו המורכבת של ECM רקמות ספציפיות בתוך קאסט יותרפורמטי פיגום omizable. בעוד צעדי עיבוד מכני האנזימטית יגרמו להפסד של ultrastructure ECM הילידים, מחקרים קודמים עם DAT הוכיחו כי ההשפעות המאלפות של ECM נגזרות השומן שמורות בפורמטי פיגום אלה, דבר המצביע על כך בהרכב bioscaffold הוא מתווך מפתח של תא פונקציה ^{^11,} ^29. יתרון משמעותי באמצעות קצף נגזרות ECM ו- microcarriers כמו מצעי תרבית תאים לעומת רקמות decellularized השלמות הוא שהם יותר הומוגנית, אשר יכולים לשפר את האחידות בחלוקת תא תאי תאים / אינטראקציות תא-ECM.

השיטות שתוארו כאן יכולות להיות מנוצלות כדי ליצור מגוון רחב של bioscaffolds רקמות ספציפיות לשימוש בתרבית תאים ויישומים-הנדסת רקמות. לדוגמה, בנוסף DAT, DDT, ו DLV, במעבדה שלנו בהצלחה יישמה טכניקות אלה ליצירת 3D porקצף יחידות ארגוני באמצעות עצם decellularized, סחוס, גרעין pulposus, סיסטיק כטבעת, כמו גם זמין מסחרי, קולגן המסיס נגזר גיד שור. מנקודת מבט במבחנה, bioscaffolds אלה יכולים לשמש כבסיס מודלי תרבות 3D גבוהים ונאמנים עבור חוקרת פתולוגיה ביולוגיה, פיזיולוגיה או מחלה הסלולר ^38, כמו מצעים ביו פלטפורמות הקרנת תרופת תפוקה גבוהה ^39, או מטריצות מלמדות על גזע תא בידול ^{^40,} ^41. קצף DAT, DDT ו- DLV מפוברק בריכוזים של 25 – 50 מ"ג / מ"ל יציבים לטווח ארוך בתרבות במבחנה (נבדק עד 28 ימים). יתר על כן, כל שלושת סוגי microcarriers יכולים לתמוך מצורף תא התפשטות בתנאים דינאמיים במערכת תרבות הטווה נמוכה גזירה (10 – 15 סל"ד) עבור 2 שבועות לפחות. עבור יישומים בחי הביולוגי biodegradaקצפי microcarriers ECM נגזרת ble הבטחה כמו-המדף מחוץ מוצרים לעורר שיפוץ רקמות ובונה והתחדשות ^{^11,} ^29. יתר על כן, פיגומים-דבק התא יכולים לשמש כמערכות משלוח טיפול בתא ^{^42,} ^43. כדוגמה, קצף DAT הוצגו לקדם אנגיוגנזה adipogenesis כאשר זורעים עם ASCs אלוגנאית ו מושתל מתחת לעור במודל חולדה עם מערכת חיסון תקינה ^29. ביחס DAT פגע, DAT מעובד יותר גבוה הקצף מושפל הרבה יותר מהר, עם ירידה של 50% בנפח ציין ב 3 שבועות כפי שהם הפכו משולבים עם הרקמות המארחות, וכמעט מוחלט ספיגה ידי 12 שבועות. עם זאת, הקצף גם מושרה תגובת אנגיוגנזה חזקה יותר, מה שמרמז כי ECM-מתעכל האנזים היה פרו-רגנרטיבית תופעות ייחודיות. באופן דומה, microcarriers הנגזרות ECM יכול לשמש במבחנה </ em> מצעי תרבית תאים בתוך מערכות התרבות דינמיות וכלי רכב מסירת תא בזריקות כמו ^{^11,} ^{^30,} ^44. באופן ספציפי יותר, משטח גדול בקוטר קטן באזור של microcarriers יכול לאפשר משלוח של כמות גדולה של תאים בנפח קטן, תוך מתן מטריצה שעשויים לעזור לתמוך כדאיות התא ולהגדיל החזקת התא באתר של הזרקת ^30. לפני שימוש בכל מערכת חיים, הוא קריטי כדי להבטיח כי ECM המקור נטול משמעותי של מרכיבים תאיים אנטיגני ו / או חומרים כימיים decellularization ציטוטוקסיות שעלולים לעורר תגובת מארח שלילית ^7.

פפסין אנזים פרוטאוליטי נפוץ בהכנת הידרוג'ל נגזרת ECM ^15. פפסין הוא פרוטאז הלא ספציפית כי תהיה לעכל חלבוני קולגן אחר ECM into שברים קטנים ^45. בעוד הידרוג'ל המפוברק מ ECM-מתעכל פפסין דווח השפעות תא-מאלף, מגבלה היא כי חומרים אלה נוטים להיות מאוד מכאניים חלשים ^46. בשנת הפיתוח הראשוני שלנו של microcarriers DAT, השתמשנו בגישה מורכבת שבו-פפסין מתעכל DAT שולב עם אלגינט והוסיף dropwise לתוך CaCl ₂ כדי ליצור חרוזים כדוריים ^30. החרוזים היו ובהמשך צילום צולב ואת אלגינט הופק באמצעות נתרן ציטרט. בנוסף הדרישה crosslinking כימיים, למגבלה העיקרית הייתה כי microcarriers מפוברק עם גישה זו הייתה יציבות עניים מתחת מגוון גודל של 900 – 950 מיקרומטר ^30. במקום פפסין, השיטות שהוצגו כאן לנצל עיכול מתון יותר של ECM עם האנזים glycolytic α-עמילאז, אשר הניחו להדבק לקבוצות פחמימות מן telopeאזורים ptide של קולגן, הגברת מסיסות ובכך חומצה אצטית ^37. גישה זו מאפשרת בידוד של קולגן פולימר מאוד שיכול לשמש ליצירת קצף microcarriers ECM הנגזרות טהור ללא צורך crosslinking כימיים או תוספים אחרים. bioscaffolds אלה התייצב באמצעות אינטראקציות פיזיות מליטה מימן בין הסיבים קולגן השתמרו היטב, בדומה הקולגן במיקרו-סביבה של ECM הילידים.

הקצף הוא פלטפורמה גמישה ביותר שיכול להיות מפוברקת במגוון רחב של גיאומטריות תלוי העובש הספציפי שנבחר. עבור מחקרי תרבית תאים, הקצף ניתן להטיל ישירות צלח היטב TCPS, ליצירת ציפויים או פיגומי 3D של משתנה עובי. לפברק קצף 3D עם משטחים מאוד אחידים, מומלץ כי עובש מנהג נועד שניתן חתום על שני הצדדים עם מגלשות פלסטיק או זכוכית. כך או ECM טחון או cryomilled יכול לשמש כדי לסנתזהקצף. באופן כללי, מצאנו כי קצף cryomilled נוטה להיות רך macroscopically ויש לי ultrastructure שבש יותר בריכוזים נמוכים ^{^31,} ^36. בהתאם למקור הרקמה, מדרגות העיבוד המכאניות הנוספות עלולות לגרום שינויים בהרכב ECM שיכול להשפיע על תפקוד תא. לדוגמה, בעבודה הקודמת שלנו, laminin זוהה קצף DLV טחון, אבל לא cryomilled DLV קצף ^31. לעומת זאת, הייתי קולגן, קולגן IV, laminin, ו פיברונקטין התגלו בשני טחון cryomilled DAT קצף ^36. בנוסף מדרגות העיבוד המכאניות, הגודל הנקבובי הנקבובי של הקצף יכול להיות מכוון במידה מסוימת על ידי שינוי ריכוז השעית ECM ואת טמפרטורת קיפאון ^47. באופן כללי, קצף ריכוז נמוך (~ 10 – 15 מ"ג / מיליליטר) הם איכותיים יותר נקבוביים, אך עלולים להתכווץ במהירות ויש ענייםיציבות בתרבות לטווח ארוך ^{^31,} ^36. באופן דומה, שיעור הקפאה איטי, בדרך כלל מושגת על ידי טמפרטורת קיפאון גבוהה, יכול לגרום נקבוביות גדולות יותר של הקצף בגלל הגודל של גבישי הקרח נוצרו במהלך הייצור ^29. כל הפרמטרים הללו עשויים להשפיע אינטראקציות תא עם החומרים, לרבות עיקול, הסתננות, לבין שיפוץ. לדוגמא, צמיחת תאים על קצף כי הם בדויים עם ריכוזי ECM גבוהים עשויה להיות מוגבלת לאזורי המשטח, במיוחד עם מקורות ECM טחונים בתנאי תרבות סטטית ^36.

עבור microcarriers, הפרמטרים המרכזיים שיכול להיות מכוון הם ריכוז השעית ECM, מחט מד, ו מתח מיושם, עם ריכוזים גבוהים יותר בדרך כלל מניבי microcarriers כי הם יותר יציבים תחת תרבות הדינמית ארוך טווח. בעקבות חניכה של electrospraying, את suspens ECMטיפות יון צריך ליפול במהירות למרכז של הבקבוק, לקראת לכיוון אספן רדיד אלומיניום. כדי למנוע צבירה, חשוב כי חרוזי קשר עם החנקן הנוזלי לפני בנייר. המרחק בין המחט ואת השטח של החנקן הנוזלי יכול להיות מותאם כדי לענות על הדרישות הללו. חשוב לציין כי אופטימיזציה ייתכן שתידרש בהתאם את המאפיינים של כל מקור ECM ספציפי, בפרט בבחירת טווח הריכוז כי יפיק bioscaffolds היציב. גורם מרכזי נוסף הוא פרוטוקול decellularization המשמש להפקת חומרי המוצא, כמו שיטות decellularization כי לבזות את ECM או נוכחות של חומרים כימיים שיורית (למשל, פעילי שטח) עלול להשפיע על יציבות שלילית של קצפים microcarriers כתוצאה. אם אתגרים הם נתקלו עם יציבות bioscaffold, אפשרויות שניתן לחקור כולל שימוש בתהליך התייבשות הדרגתי יותר, הגדלת תליוני ECMריכוז ension, ולחקור טחון לעומת ECM cryomilled. האם כל אחת מהאפשרויות הללו לא מצליחים לפתור את הבעיה, ייתכן שיהיה צורך לחקור פרוטוקולים decellularization אלטרנטיבית או מקורות ECM.

כדי להבטיח שחזור במהלך ייצור גרדום, טיפול מיוחד יש לנקוט בכל צעדים מסוימים בפרוטוקול. כאשר cryomilling הרקמות decellularized, מומלץ כי טחינה להתנהל מיד לאחר lyophilization בסביבה יבשה כדי להפחית את הסיכוי של אגרגציה בשל ספיגת לחות מהסביבה. במהלך ייצור microcarrier, הוא הציע כי ההשעיה היא electrosprayed בקבוצות קטנות, עם נפח מקסימאלי של 3 מיליליטר, כדי למנוע בעיות עם קירור מדגם שיכול לגרום לסתימה של המחט. יתר על כן, זה הכרחי כי microcarriers אינם רשאים להפשיר לאחר תהליך electrospraying. כדי לשמור על הגיאומטריה הכדורית שלהם ויציבות מכנית, microcarriERS יש לאסוף מן חנקן נוזלי, מועבר במיכל חנקן נוזלי מלא, ומיד lyophilized. לבסוף, הן עבור הקצפים microcarriers, זה קריטי, כי צעדי ההתייבשות מבוצעים לאט על פני תקופה של מספר ימים. התייבשות מהירה עלולה לגרום לקריסה מבנית על המקרו ו / או בקנה מידת מייקרו. בהמשך, התייבשות חייב להתרחש באיטיות כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר קטנות בתוך הפיגום, אשר יכול לדרוש כמות משמעותית של זמן דגה תחת ואקום אור.

לסיכום, השיטות שהוצגו במאמר זה יכול לשמש כדי לפברק מגוון רחב של קצף רקמות ספציפיות ו microcarriers המורכבת ECM הטהור, הלא-כימי צולבים. יתרון לחוקרים ביולוגיים הוא כי bioscaffolds קל לטפל וניתן מעובד בדומה רקמות בעת ביצוע ניתוחים עם טכניקות כגון היסטולוגיה, אימונוהיסטוכימיה, או גן מבחני חלבון ביטוי.בנוסף, הפיגומים נגזרים ECM יכולים להיות מושפלים enzymatically לחלץ אוכלוסיות תאי זרע או יכולים לשמש ישירות כרכב משלוח התא מתכלה ביולוגי. בסך הכל, פלטפורמה טכנולוגית גמישה זו מחזיק כלי נהדר עבור יישומים רבים, כוללים ללימודי תרבות תאי 3D חוקרים את תפקוד תא, כמו מצעי הרחבת תא, וכתוצאת bioscaffolds פרו-רגנרטיבית.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada and the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) have provided funding for this work. The authors would like to acknowledge Dr. Amin Rizkalla for the use of his electrospraying system, the Nanofabrication Facility at Western University for use of SEM imaging equipment, the Mount Brydges Abattoir for the provision of porcine tissue samples, and Drs. Aaron Grant, Brian Evans, and Robert Richards for their clinical collaborations in support of this research.

Materials

Acetic acid, glacial	BioShop	ACE222.500
Alligator clip leads	VWR	470149-728
Aluminium foil	Fisher Scientific	01-213-101
a-amylase	Sigma	101074694	from Aspergillus aryzae
Analytical balance	Sartorius	CPA225D
Centrifuge	Thermo Scientific	75004251	With swinging bucket rotor for 15 and 50 mL centrifuge tubes
Centrifuge tubes (15 mL)	Sarstedt	62.554.205
Centrifuge tubes (50 mL)	Sarstedt	62.547.205
Collagen from bovine achilles tendon (insoluble)	Sigma	C9879	Or similar insoluble collagen source; Can be used as an alternative to decellularized tissues to fabricate the foams and microcarriers
Cryomilling system	Retsch	20.745.0001	MM 400
Dessicator	Fisher Scientific	8624426	For lyophilized ECM and bioscaffold storage
DMEM: F12 Hams	Sigma	D6421	Used for proliferation media
Dewar flask	Fisher Scientific	10-196-6	Low form; volume range of 250 – 500 mL
Double distilled water			From Barnstead GenPure xCAD Water Purification System
D-PBS	Wisent	311425125
ECM			Isolated from human adipose tissue, porcine dermis or porcine myocardium, as described in Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010, and Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32)
Ethanol	Greenfield Specialty Alcohols Inc.	P016EAAN	Absolute
Fetal bovine serum	Wisent	80150	Used for proliferation media
Forceps	VWR	37-501-32	For transferring the foams
Freezer (-20 °C)	VWR	97043-346
Freezer ( -80 °C)	Thermo Scientific	EXF40086A
Glass vials	Fisher Scientific	03-339-26D	To store lyophilized cryomilled ECM
Hand held homogenizer	Fisher Scientific	14-359-251	Speed: 8000 – 30,000 RPM
Homogenizer accessories: saw tooth bottom generator probes	Fisher Scientific	14-261-17	10 X 95 mm
Liquid nitrogen			For electrospraying
Lyophilizer	Labconco	7750021	FreeZone4.5
Milling chamber	Retsch	02.462.0213	25 mL volume recommended
Milling balls	VWR	16003-606	10 mm diameter, stainless steel recommended
18G needle	VWR	C ABD305185	For dispensing ECM suspension into moulds
Orbital incubator shaker	SciLogex	832010089999	Temperature controlled (37 °C)
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140-122	Used for proliferation media
Pipet-Aid XP	Mandel Scientific	DRU-4-000-101
Retort stand	VWR	470019-526
Retort stand clamp	VWR	21573-606
Safety-Lok Syringe	BD	309606	3 mL luer lock syringe for microcarrier fabrication and dispensing ECM suspension
Serological pipettes (10 mL )	Sarstedt	86.1254.001
Serological pipettes (25 mL)	Sarstedt	86.1685.001
Sodium chloride	BioShop	7647-14-5
Sodium phosphate monobasic	BioShop	10049-21-5
Scoopula	VWR	89259-968	For collecting microcarriers
Surgical scissors	VWR	82027-590
Syringe pump	VWR	10117-490	Microprocessor controlled
High voltage power supply	Gamma High Voltage Research	ES30P-5W/DDPM	Capable of recommended 15 – 25 kV voltage range
12-well plates	Fisher Scientific	12565321	For use as molds during foam fabrication; Other sizes or user-defined molds can also be selected
Winged infusion set	Terumo	22258092	30 cm tubing length, 25 G 3/4 " recommended; Other needle gauges can be used and may influence microcarrier diameter

References

Eweida, A. M., Marei, M. K. Naturally Occurring Extracellular Matrix Scaffolds for Dermal Regeneration: Do They Really Need Cells?. Biomed Res Int. , 1-9 (2015).
Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
Rosso, F., Giordano, A., Barbarisi, M., Barbarisi, A. From Cell-ECM Interactions to Tissue Engineering. J. Cell. Phys. 199 (2), 174-180 (2004).
Du, J., et al. Extracellular Matrix Stiffness Dictates Wnt Expression Through Integrin Pathway. Sci. Rep. 6, 4195-4200 (2016).
Badylak, S. F. The Extracellular Matrix as a Scaffold for Tissue Reconstruction. Cell & Dev. Biol. 13 (2), 377-383 (2002).
Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of Tissues and Organs. Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).
Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An Overview of Tissue and Whole Organ Decellularization Processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
Reing, J. E., et al. The Effects of Processing Methods Upon Mechanical and Biologic Properties of Porcine Dermal Extracellular Matrix Scaffolds. Biomaterials. 31 (33), 8626-8633 (2010).
Yang, Q., et al. Morphological Appearance, Content of Extracellular Matrix and Vascular Density of Lung Metastases Predicts Permissiveness to Infiltration by Adoptively Transferred Natural Killer and T Cells. Cancer Immun. Immunother. 55 (6), 699-707 (2006).
Calle, E., Ghaedi, M., Sundaram, S., Sivarapatna, A., Tseng, M. K., Niklason, L. E. Strategies for Whole Lung Tissue Engineering. IEEE Trans. Biomed. Eng. 61 (5), 1482-1496 (2014).
Turner, A. E. B., Yu, C., Bianco, J., Watkins, J. F., Flynn, L. E. The Performance of Decellularized Adipose Tissue Microcarriers as an Inductive Substrate for Human Adipose-Derived Stem Cells. Biomaterials. 33 (18), 4490-4499 (2012).
Brown, C. F. C., Yan, J., Han, T. T. Y., Marecak, D. M., Amsden, B. G., Flynn, L. E. Effect of Decellularized Adipose Tissue Particle Size and Cell Density on Adipose-Derived Stem Cell Proliferation and Adipogenic Differentiation in Composite Methacrylated Chondroitin Sulphate. Biomed. Mater. 10 (4), 1-12 (2015).
Cheung, H. K., Han, T. T. Y., Marecak, D. M., Watkins, J. F., Amsden, B. G., Flynn, L. E. Composite Hydrogel Scaffolds Incorporating Decellularized Adipose Tissue for Soft Tissue Engineering with Adipose-Derived Stem Cells. Biomaterials. 35 (6), 1914-1923 (2014).
Almeida, H. V., Eswaramoorthy, R., Cunniffe, G. M., Buckley, C. T., O’Brien, F. J., Kelly, D. J. Fibrin Hydrogels Functionalized with Cartilage Extracellular Matrix and Incorporating Freshly Isolated Stromal Cells as an Injectable for Cartilage Regeneration. Acta Biomat. 36, 55-62 (2016).
Wassenaar, J. W., Braden, R. L., Osborn, K. G., Christman, K. L. Modulating in vivo Degradation Rate of Injectable Extracellular Matrix Hydrogels. J. Mater. Chem. B. 4 (16), 2794-2802 (2016).
Ugerleider, J. L., et al. Extracellular Matrix Hydrogel Promotes Tissue Remodeling, Arteriogenesis, and Perfusion in a Rat Hindlimb Ischemia Model. JACC Basic Transl. Sci. 1 (1-2), 32-44 (2015).
Nagao, R. J., et al. Decellularized Human Kidney Cortex Hydrogels Enhance Kidney Microvascular Endothelial Cell Maturation and Quiescence. Tissue Eng. Part A. 22 (19-20), 1140-1150 (2016).
Pati, F., et al. Printing Three-Dimensional Tissue Analogues with Decellularized Extracellular. Matrix Bioink. Nat. Commun. 5, 3935 (2014).
Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. 3D Cell Culture Systems – Advantages and Applications. J. Cell. Phys. 230 (1), 16-26 (2015).
Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. Three-dimensional Cell Culture Matrices: State of the Art. Tissue Eng Part B, Rev. 14 (1), 61-86 (2008).
Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The Third Dimension Bridges the Gap Between Cell Culture and Live Tissue. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
Bouet, G., Marchat, D., Cruel, M., Malaval, L., Vico, L. In Vitro Three-Dimensional Bone Tissue Models: From Cells to Controlled and Dynamic Environment. Tissue Eng. Part B Rev. 21 (1), 133-156 (2015).
Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. Gene Expression Perturbation in vitro – A Growing Case for Three-Dimensional (3D) Culture Systems. Sem. Cancer Biol. 15 (5), 405-412 (2005).
Bonnier, F., et al. Cell Viability Assessment Using the Alamar Blue Assay: A Comparison of 2D and 3D Cell Culture Models. Toxicology in vitro. 29 (1), 124-131 (2015).
Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The Extracellular Matrix at a Glance. J. Cell Sci. 123, 4195-4200 (2010).
Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. Differential Effects of Tissue Culture Coating Substrates on Prostate Cancer Cell Adherence, Morphology and Behavior. PLoS ONE. 9 (11), e112122 (2014).
McKee, C., Perez-Cruet, M., Chavez, F., Chaudhry, G. R. Simplified Three-Dimensional Culture System for Long-Term Expansion of Embryonic Stem Cells. World J. Stem Cells. 7 (7), 1064-1077 (2015).
Flynn, L. E. The Use of Decellularized Adipose Tissue to Provide an Inductive Microenvironment for the Adipogenic Differentiation of Human Adipose-Derived Stem Cells. Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).
Yu, C., et al. Porous Decellularized Adipose Tissue Foams for Soft Tissue Regeneration. Biomaterials. 34 (13), 3290-3302 (2013).
Turner, A. E. B., Flynn, L. E. Design and Characterization of Tissue-Specific Extracellular Matrix-Derived Microcarriers. Tissue Eng. Part C: Methods. 18 (3), 186-197 (2012).
Russo, V., Omidi, E., Samani, A., Hamilton, A., Flynn, L. E. Porous, Ventricular Extracellular Matrix-Derived Foams as a Platform for Cardiac Cell Culture. Biores Open Access. 4 (1), 374-388 (2015).
Wainwright, J. M., et al. Preparation of Cardiac Extracellular Matrix from an Intact Porcine Heart. Tissue Eng. Part C, Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
Owen, S. C., Fisher, S. A., Tam, R. Y., Nimmo, C. M., Shoichet, M. S. Hyaluronic Acid Click Hydrogels Emulate the Extracellular Matrix. Langmuir. 29 (24), 7393-7400 (2013).
Zargham, S., Bazgir, S., Tavakoli, A., Rashidi, A. S., Damerchely, R. The Effect of Flow Rate on Morphology and Deposition Area of Electrospun Nylon 6 Nanofiber. J. Eng. Fibers Fabr. 7 (4), 42-49 (2012).
Gryshkov, O., Pogozhykh, D., Zernetsch, H., Hofmann, N., Mueller, T., Glasmacher, B. Process Engineering of High Voltage Alginate Encapsulation of Mesenchymal Stem Cells. Mater. Sci. Eng. C Biol. Appl. 36, 77-83 (2014).
Turco, B. . Characterization and Cell-Seeding of Decellularized Adipose Tissue Foams for Wound Healing. , (2014).
Steven, F. S. The Nishihara Technique for the Solubilization of Collagen. Application To the Preparation of Soluble Collagens From Normal and Rheumatoid Connective Tissue. Ann. Rheum. Dis. 23, 300-301 (1964).
Hansen, N. U. B., Genovese, F., Leeming, D. J., Karsdal, M. A. The Importance of Extracellular Matrix for Cell Function and in vivo Likeness. Exp. Mol. Pathol. 98 (2), 286-294 (2015).
Justice, B. A., Badr, N. A., Felder, R. A. 3D Cell Culture Opens New Dimensions in Cell-Based Assays. Drug Discov. Today. 14 (1-2), 102-107 (2009).
Cortiella, J., et al. Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation. Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2565-2580 (2010).
Liao, J., Guo, X., Grande-Allen, K. J., Kasper, F. K., Mikos, A. G. Bioactive Polymer/Extracellular Matrix Scaffolds Fabricated with a Flow Perfusion Bioreactor for Cartilage Tissue Engineering. Biomaterials. 31 (34), 8911-8920 (2010).
Choi, Y. C., Choi, J. S., Woo, C. H., Cho, Y. W. Stem Cell Delivery Systems Inspired by Tissue-Specific Niches. J. Control. Release. 193, 42-50 (2014).
Han, T. T. Y., Toutounji, S., Amsden, B. G., Flynn, L. E. Adipose-Derived Stromal Cells Mediate in vivo Adipogenesis , Angiogenesis and Inflammation in Decellularized Adipose Tissue Bioscaffolds. Biomaterials. 72, 125-137 (2015).
Yu, C., Kornmuller, A., Flynn, L. E. Porous Decellularized Extracellular Matrix Microcarriers for Tissue-Specific Cell Expansion and Delivery. Front. Bioeng. Biotechnol. , (2016).
Qian, J., et al. Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin. J. Food Sci. 81 (1), C27-C34 (2016).
Lin, H., Yang, G., Tan, J., Tuan, R. S. Influence of Decellularized Matrix Derived from Human Mesenchymal Stem Cells on their Proliferation, Migration and Multi-Lineage Differentiation Potential. Biomaterials. 33 (18), 4480-4489 (2012).
Fonte, P., Reis, S., Sarmento, B. Facts and Evidences on the Lyophilization of Polymeric Nanoparticles for Drug Delivery. J. Control. Release. 225, 75-86 (2016).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citer Cet Article

Kornmuller, A., Brown, C. F., Yu, C., Flynn, L. E. Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms. J. Vis. Exp. (122), e55436, doi:10.3791/55436 (2017).