Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Anna Kornmuller; Cody F.C. Brown; Claire Yu; Lauren E. Flynn

doi:10.3791/55436

JoVE Journal > Bioengineering

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Bio-ingénierie

Die Herstellung von extrazellulären Matrix-derived Foams und Mikroträgern als gewebespezifische Zellkultur und Delivery-Plattformen

Published: April 11, 2017

doi:

10.3791/55436

Anna Kornmuller¹, Cody F.C. Brown², Claire Yu³, Lauren E. Flynn^2,4

¹Biomedical Engineering Graduate Program,The University of Western Ontario, ²Department of Anatomy & Cell Biology, Schulich School of Medicine & Dentistry,The University of Western Ontario, ³Department of Chemical Engineering,Queen’s University, ⁴Department of Chemical & Biochemical Engineering, Faculty of Engineering,The University of Western Ontario

Summary

Die gewebespezifischen extrazellulären Matrix (ECM) ist ein wichtiger Vermittler der Zellfunktion. Dieser Artikel beschreibt Verfahren zur Synthese von reinem ECM-derived Schaumstoffen und Microcarriern , die ohne die Notwendigkeit für eine chemische Vernetzung für Anwendungen in der modernen 3D in vitro Zellkulturmodellen oder als Pro-regenerative bioscaffolds in Kultur stabil ist.

Abstract

Zellfunktion wird durch Interaktionen mit der extrazellulären Matrix (ECM) vermittelt, die komplexen Gewebe-spezifische Zusammensetzung und Architektur hat. Der Schwerpunkt dieses Artikels ist auf die Verfahren zur ECM-derived porösen Schaumstoffen und Microcarriern zur Verwendung als biologisch relevanten Substraten in fortgeschrittenen 3D in vitro Zellkulturmodellen oder als Pro-regenerative Gerüsten und Zellabgabesysteme für das Tissue Engineering und der regenerativen Medizin hergestellt wird . Verwendung dezellularisierte Gewebe oder gereinigter unlöslichen Kollagen als Ausgangsmaterial, können die Techniken, um eine breite Palette von gewebsspezifischen bioscaffolds mit anpassbaren Geometrien zu synthetisieren, angewandt werden. Der Ansatz beinhaltet die mechanische Bearbeitung und milde enzymatische Verdauung ein ECM Suspension zu erhalten, die verwendet wird, um die dreidimensionalen Schäume oder Microcarriern durch kontrolliertes Einfrieren und Gefriertrocknung Verfahren herzustellen. Diese reinen ECM-derived Gerüste sind hochporös, aber dennoch stabil, ohne dass chemical-Vernetzern oder anderen Additiven, die sich negativ auf die Zellfunktion beeinflussen können. Das Gerüst Eigenschaften können durch Verändern Faktoren wie die ECM Suspensionskonzentration, mechanische Bearbeitungsverfahren oder Synthesebedingungen zu einem gewissen Grad eingestellt werden. Im Allgemeinen sind die Gerüste robust und einfach zu handhaben und können als Gewebe für die meist Standard-biologische Assays verarbeitet werden, eine vielseitige und benutzerfreundliche 3D-Zellkultur-Plattform bereitstellt, die die native ECM Zusammensetzung nachahmt. Insgesamt belegen diese einfachen Verfahren zur Herstellung von kundenspezifischen ECM-derived Schaumstoffen und Microcarriern können als gewebespezifische zell instruktiv Plattformen für in vitro- und in vivo – Anwendungen sowohl für Biologen und biomedizinische Ingenieure von Interesse sein.

Introduction

Die extrazelluläre Matrix (ECM) besteht aus einem komplexen 3D – Netzwerk von Proteinen, Glycoproteinen besteht, und Polysaccharide ^1. Einmal als überwiegend struktureller Rahmen betrachten, ist es nun allgemein anerkannt , dass das ECM ² eine Vielfalt von bioaktiven Molekülen mit wichtigen funktionellen Rollen enthält. Zell-ECM – Wechselwirkungen können das Überleben von Zellen, Adhäsion, Migration, Proliferation und Differenzierung ³ lenken. Während die Hauptklassen von ECM Makromolekülen im Allgemeinen über Gewebe und Spezies gut konserviert sind, hat jedes Gewebe eine einzigartige Matrix – Zusammensetzung und Architektur ^4. Insgesamt bietet das gewebespezifische ECM eine instruktive Mikroumgebung , die Funktion aus dem subzellulären zu dem Gewebe / Organ Skala ⁵ vermittelt.

Aufgrund der kritischen Rolle der ECM zelluläre Funktion bei der Vermittlung gibt es in der de zunehmende Interesse wurdewicklung von ECM-derived bioscaffolds für Anwendungen in der Gewebezüchtung und regenerative Medizin. Insbesondere hat das Verfahren der Dezellularisierung worden als ein Mittel zur Erlangung ECM aus einem breiten Bereich von Geweben für die Verwendung als Gerüstmaterial für eine Geweberegeneration und Zellabgabe ^{^5,} ^{^6,} ⁷ ausgiebig erforscht. Dezellularisierung beinhaltet typischerweise eine Reihe von mechanischen, chemischen und / oder biologischen Behandlungsstufen gezielt an Zellen und Zellbestandteile zu entfernen, während im Idealfall minimal Veränderungen an die 3D – Struktur und die Zusammensetzung des ECM ⁸ verursacht. Durch Vermessung der Literatur können verschiedene Dezellularisierung Protokolle für nahezu alle Gewebe im Körper ⁷ identifiziert werden.

Während dezellularisierten Geweben direkt als implantierbare Gerüste verwendet werden können, oder 3D-Zellkultursubstrate, können zelluläre Infiltrationin Gewebe mit einer dichten Struktur ECM ⁹ begrenzt werden. Ferner führt die natürliche Heterogenität in der ECM kann Variabilität in der Zellanheftung und Verteilung innerhalb der dezellularisierten Matrizen, die möglicherweise ¹⁰ die zelluläre Antwort auswirken könnten. Insgesamt, während für einige Anwendungen vielversprechend, dezellularisierten Gewebe in ihrer intakten Form bietet begrenzte Vielseitigkeit in Bezug auf den Tuning – Gerüsts Eigenschaften einschließlich Form, Porosität und Steifigkeit sowie die Art der Lieferung für in vivo – Anwendungen angewandt wird .

Um diese Einschränkungen, zahlreiche Forschungsgruppen anwenden weitere Verarbeitungsverfahren zu umgehen, um maßgeschneiderte Gerüstformate dezellularisierten Gewebe als ein Basismaterial zu erzeugen. In der einfachsten Form kann dies beinhalten das dezellularisierte Gewebe Cryomahlung injizierbare gewebsspezifische ECM Partikel ¹¹ zu erzeugen. Diese ECM-Teilchen können als zell Instru eingebaut werdenctive Komponente in Verbundgerüsten mit anderen Biomaterialien, wie beispielsweise in situ – Vernetzungs Hydrogelen ^{^12,} ^{^13,} ^14. Neben der mechanischen Bearbeitung kann dezellularisiert Gewebe auch mit proteolytischen und / oder glykolytische Enzyme herzustellen ECM-derived Hydrogele, Schäumen, Mikroträger und Beschichtungen ^{^15,} ^{^16,} ^17, sowie zu synthetisieren bioinks für 3D – Druck zu enzymatischen Verdau unterzogen werden , ^18.

Neben Gewebe-Engineering – Anwendungen, ECM-derived bioscaffolds halten großes Potenzial für die Erzeugung höherer Genauigkeit de – vitro – Modellen für die biologische Forschung. Es besteht ein erheblicher Bedarf an 3D – Zellkultursysteme zu entwickeln, die besser das native zelluläre Mikro ¹⁹ rekapitulieren. Die meisten in vitro – cell Kulturuntersuchungen bisher auf Gewebskultur – Polystyrol (TCPS) durchgeführt, die innerhalb von lebendem Gewebe ²⁰ gefunden geringe Korrelation mit dem biologisch komplexen und dynamischem zellulären Milieu aufweist. Während praktisch für zelluläre Interaktionen innerhalb einer kontrollierten Umgebung zu studieren, Kultivieren von Zellen auf dieser vereinfachten starren Substrate 2D ändert Zellanheftung und Morphologie sowie sowohl die Zell-Zell- und Zell-ECM – Wechselwirkungen ^{^21,} ^22. Die zellulären Anpassung auf 2D TCPS beobachtet können intrazelluläre Signalweg beeinflussen , die verschiedenen Zellfunktionen einschließlich Überleben regulieren, Proliferation, Migration und Differenzierung, ²³ Fragen der Relevanz von 2D – Studien bei der Modellierung in vivo – Systemen zu erhöhen. Es wurde zunehmend erkannt , dass das Zellverhalten ²⁴ stark in 2D im Vergleich zu 3D – Systemen variieren kann, und dass biochemische und biomechanical Signalisierung mit dem ECM sind wichtige Mediatoren der Zellfunktion ^25. Viele Gruppen haben versucht, die Grenzen der etablierten 2D-Systeme zu überwinden, indem TCPS Beschichtung mit ECM-Komponenten wie Kollagen, Laminin und Fibronektin. Während diese Strategien können Zellanheftung verbessern und zelluläre Reaktionen verändern können, bleiben diese Modelle durch ihre 2D – Konfiguration beschränkt , die nicht die komplexe räumliche Organisation oder Biochemie der nativen ECM ^{^26,} ²⁷ nicht nachahmen.

Unsere Biotechnik Labor hat bei der Entwicklung von ECM-derived bioscaffolds als Substrate für 3-D Zellkultur und Gewebe-Engineering-Anwendungen interessiert. Insbesondere haben wir die Verwendung von dezellularisierten Fettgewebes (DAT) als Gerüstplattform für adipöse Regeneration ²⁸ Pionierarbeit geleistet. Darüber hinaus haben wir etablierte Methoden für 3D-Mikro und poröse Schäume Synthese D mitAT mit dem proteolytischen Enzym Pepsin oder glykolytischen Enzym verdaut α-Amylase , ^{^29,} ^{^30,} ^31. Bemerkenswerterweise haben wir auf all diese Gerüsten Formate gezeigt, dass das Fettgewebe gewonnene ECM für die adipogene Differenzierung von menschlichem Fettgewebe abgeleiteten Stammzellen / Stromazellen (ASCs) in der Kultur ein induktives Mikroumgebung zur Verfügung stellt. In jüngster Zeit haben wir unsere Herstellungsverfahren 3D poröse Schäume aus α-Amylase-verdaute Schweinen dezellularisierenden linke Ventrikel (DLV) zu erzeugen (Dezellularisierung Methoden von Wainwright al et angepasst. ^32), und zeigten , dass sie eine unterstützende Plattform zur Induzierung früh kardiomyogenen bieten Marker – Expression in human perikardialen Fett abgeleiteter ASCs ^31.

Dieser Artikel beschreibt im Detail die Verfahren zur Synthese von nicht-chemisch vernetzten 3D porösen Schäumen und Mikro abgeleitet reinvon ECM für die Verwendung als biologisch komplex 3D in vitro Zellkultursubstrate und als Biomaterialien für die Geweberegeneration α-Amylase-verdaut. In der Theorie kann jede ECM Quelle mit hohem Molekulargewicht Kollagen enthält, kann als Ausgangsmaterial für diese Techniken verwendet. Um die Flexibilität dieses Ansatzes zu demonstrieren, haben die Verfahren angewendet wurden gewebsspezifische bioscaffolds unter Verwendung von humanen DAT, porcine dezellularisierten dermalen Gewebe (DDT) ⁸ und porcine DLV als repräsentative Beispiele zu erzeugen. Abbildung 1 stellt einen visuellen Überblick über das Herstellungsverfahren für den ECM-derived Schaumstoffen und Microcarriern.

Abbildung 1. Überblick über das Verfahren zur Herstellung des Tissue-spezifischen ECM-derived Foams und Mikroträger . 1. Dezellularisierte Gewebe, zubereitet folgenden etablierten Decellularization Protokolle können für gewebespezifische ECM-derived biologisches Gerüst Herstellung verwendet werden. Makroskopische Bilder werden von hydratisiertem menschlichen DAT gezeigt (hergestellt wie in Flynn 2010 ²⁸ beschrieben), Schweine – DDT (hergestellt wie in Reing, JE, et al. 2010 ⁸⁾ und Schweine – DLV (hergestellt wie in Wainwright et al. 2010 ³² ), als repräsentative Beispiele von ECM-Quellen, die als Ausgangsmaterialien verwendet werden können. Maßstabsbalken repräsentieren 3 cm. 2. Die dezellularisierte Gewebe lyophilisiert und dann 3. mechanisch zerkleinert. Skalenbalken stellen 1 cm. 4. Das zerkleinerte ECM kann dann gefroren vermahlen werden, die für die Schaumherstellung ist optional, aber erforderlich für Mikro Synthese. Maßstabsleiste 3 mm darstellt. 5. Das zerkleinerte oder gefroren vermahlen ECM wird dann mit α-Amylase verdaut und homogenisiert , um eine homogene Suspension ECM zu schaffen. Maßstabsbalken entspricht 1 cm. <strOng> 6a) für die Schaumstoffherstellung wird die ECM Suspension in eine benutzerdefinierten Form, gefrorener überführt und lyophilisiert , um ein poröses 3D – Gerüst mit einer gut definierten Geometrie zu erzeugen. Maßstabsbalken entspricht 1 cm. 6b) zum Mikroträgerherstellung, die gefroren vermahlen ECM Suspension wird elektrogesprüht diskrete sphärische Mikrocarriern zu erzeugen. Maßstabsbalken stellt 2 mm. 7. Die Schäume und Mikro können dann nach und nach rehydriert und mit Zellen besät. Repräsentative Bilder von menschlichen ASCS (lebenden Zellen = grün) gezeigt ausgesät auf einem DAT-Schaum (links) und DAT Mikro (rechts). Maßstabsbalken entspricht 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Protocol

1. Dezellularisierte Gewebeverarbeitung Dezellularisierung und Lyophilisation Dezellularisieren Gewebe (n) von Interesse nach einem festgelegten Protokoll. HINWEIS: Scaffolds in der aktuellen Studie wurde DAT 28, Schweine DDT 8 folgende veröffentlichte Dezellularisierung Protokolle für die menschlichen vorbereitet und Schweine DLV 32. Im Handel verfügbar ist, kann unlöslicher Kollagen auch aus Rindersehne bezogen Schaumstoffen und Microcarriern, wie Kollagen zur Herstellung verwendet werden, die erfolgreich über einen Konzentrationsbereich von 10 verwendet wurden, – 50 mg / mL. Andere unlösliche Kollagenquellen verwendet werden können, können jedoch die Optimierung erfordern den Konzentrationsbereich zu identifizieren, die stabil Gerüste ergeben. Übertragen der hydratisierten dezellularisierte Gewebe oder gereinigtem Kollagen in ein 50 ml – Zentrifugenröhrchen mit einer Pinzette und füge ausreichend doppelt destilliertem Wasser (ddH 2 O) , um das Gewebe zu versenken, toa maximale Gesamtvolumen von 35 ml. Gefrieren die Probe über Nacht bei -80 ° C, mit dem Zentrifugenrohr horizontal positioniert während des Einfrierens die Oberfläche für Sublimation während der anschließenden Gefriertrocknung zu maximieren. Entfernen der Kappe aus dem Zentrifugenröhrchen übertragen, und die gefrorene Probe in eine Gefriertrocknungs Glas. Lyophilisieren die Probe eines Laborgefriertrockner für 48 bis 72 h oder bis sie vollständig getrocknet. HINWEIS: Die Trocknungszeit für verschiedene lyophilizers variieren kann und dezellularisierenden Gewebe. Fein zerkleinert das lyophilisierte ECM in kleine Stücke (~ 1 bis 2 mm 3) mit scharfer chirurgischer Schere. Bewahren Sie die gehackte ECM in einem Exsikkator bis zur Weiterverarbeitung bereit. HINWEIS: Es wird empfohlen, dass das zerkleinerte ECM sofort verwendet wird Feuchtigkeitsaufnahme aus der Umgebung zu verhindern. Cryomahlung (optional für die Schaumherstellung) Füllen Sie einen 25 ml Edelstahl Mahlraum für eine Laboratory Kugelmühle System mit lyophilisierten ECM zerkleinert und zwei 10 mm Kugeln aus rostfreiem Stahl Fräsen hinzuzufügen. Schließen und vollständig die geladenen Mahlkammer in flüssigem Stickstoff für 3 Minuten unterzuzutauchen. Mühle die gefrorene Probe für 3 min bei 30 Hz (1800 Umdrehungen pro Minute). Wiederholen Sie die Schritte 1.2.2 und 1.2.3 bis das ECM zu einem feinen Pulver gemahlen wird. HINWEIS: Die Anzahl der Male diese Schritte wiederholt werden, sollte zwischen ECM Quellen variieren. Zum Beispiel erfordert DAT typischerweise 3 Mahlzyklen um ein feines Pulver zu erzeugen. Übertragen, wobei das Pulver einer Spatel in einen Glaskolben verwendet wird, dicht verschließen, und lagert in einem Exsikkator. ECM Suspension Vorbereitung Man wiege 250 mg der beiden gehacktem (für Schäume) oder gefroren vermahlen (für Schäume oder Microcarriern) ECM und übertragen sie in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Siehe 1.1.6 und Abschnitt Schritt 1.2 zur Herstellung von gehackten ECM und gefroren vermahlen ECM, respectively. Hinweis: Dieses Protokoll ist für eine 50 mg / ml ECM suspen vorzubereitension, die für den menschlichen DAT, Schweine DDT und Schweine DLV empfohlen. Abhängig von der spezifischen ECM Quelle können einheitliche Suspensionen bei höheren oder niedrigeren Ausgangskonzentrationen erzeugt werden. 5 ml 0,22 M NaH 2 PO 4 (pH 5,4) Puffer in die Zentrifugenröhre und markiert die Flüssigkeitspegel auf dem Schlauch. Vorbereiten eine α-Amylase – Stammlösung durch Zugabe von 7,5 mg α-Amylase zu 1 ml 0,22 M NaH 2 PO 4 (pH 5,4) -Puffer. Füge 100 & mgr; l der α-Amylase-Stammlösung (0,75 mg α-Amylase, 0,3% w / w Trockengewebe) zu der Probe. Hinzufügen 0,22 M NaH 2 PO 4 auf ein Endvolumen von 10 ml zu erhalten. Agitieren die Suspension kontinuierlich bei 300 Upm für 72 h bei Raumtemperatur. Zentrifugiere die Suspension bei 1.500 xg für 10 min. Vorsichtig sammeln und den Überstand verwerfen, ohne das verdaute ECM-Pellet zu stören. Resuspendieren der pelletierte Material in 10 ml 5% NaCl verdünnt in ddH 2 O. Wiederholen Sie Schritt 1.3.5 für insgesamt zwei Spülungen mit 5% NaCl in ddH 2 O. Überstand verwerfen und resuspendieren Das pelletierte Material in 10 ml ddH 2 O. Agitieren die Suspension kontinuierlich bei 300 rpm für 10 min bei RT. Zentrifugiere die Suspension bei 1.500 xg für 10 min. Vorsichtig sammeln und den Überstand verwerfen, ohne das verdaute ECM-Pellet zu stören. Zugabe von 0,2 M Essigsäure zu der Markierung 5 ml hergestellt in Schritt 1.3.2. Agitieren die Suspension kontinuierlich auf 120 rpm O / N bei 37 ° C. Homogenisieren der ECM Suspension bei Raumtemperatur in Zehn-Sekunden-Intervallen einen handgehaltenen Homogenisator mit einem Sägezahn 10 mm breiten Sonde ausgestattet war, bis keine sichtbaren Fragmente bleiben. Legen Sie die Suspension in einem Becher mit kaltem Wasser zwischen den Homogenisieren Abständen einer Überhitzung zu vermeiden. HINWEIS: In Abhängigkeit von der ECM Quelle, einem weiteren Verdünnung in 0,2 M Essigsäure erforderlich sein kann, um eine homogene Suspension zu erhalten. Excessive Kühlung der ECM Suspension kann in einer Erhöhung der Viskosität führen, die mit einem effizienten Homogenisierung stören können. Wenn eine Erhöhung der Viskosität festgestellt wird, kann die Probe auf die weitere Verarbeitung auf 37 ° C und einer wieder erwärmt werden. Lagerung bei 4 ° C für bis zu einem Monat vor dem Schaum oder Mikrofertigung. 2. ECM-derived Foam Fabrication Inkubiere die ECM Suspension aus Schritt 1.3.13 (zerhackt oder gefroren vermahlen) bei 37 ° C unter kontinuierlichem Rühren bei 120 Umdrehungen pro Minute, bis die Suspension warm ist. Verdünne die ECM-Suspension in 0,2 M Essigsäure sauer auf die gewünschte Konzentration. HINWEIS: – 100 mg / ml, mit 15 bis 50 mg / ml als der empfohlenen Bereich für DAT, DDT und DLV In Abhängigkeit von der ECM-Quelle, stabile Schäume können im Bereich von 10 hergestellt werden. Typischerweise bei höheren Konzentrationen hergestellt Schäume werden etwas weniger porös, aber stabiler in Kultur und leichter zu handhaben. Unter Verwendung einer 3 ml Spritze with einer 18 G Nadel Blasenbildung in der ECM-Suspension, füllt die gewünschte Form mit der ECM-Suspension zu verhindern. Um den DAT, DDT, und DLV Schäume herzustellen, verzichtet werden 400 & mgr; l von 35 mg / ml ECM-Suspension in eine 48-Well-Zellkultur-behandelten Platte. HINWEIS: Die Form der gewählten Form und das Volumen der Suspension ECM werden die Geometrie des resultierenden Schaums bestimmen. Abdecken und gefrier die Formen über Nacht indem sie in einem -20 ° C oder -80 ° C Gefrierschrank platziert. HINWEIS: Die Gefriertemperatur die Porosität der Schäume beeinflussen können. Größere Poren erwartet werden , wenn die Proben bei -20 ° C eingefroren werden , im Vergleich zu -80 ° C durch die Bildung von größeren Eiskristallen 33. Um Schaumstoffe mit einer gleichförmigen porösen Struktur herzustellen, sicherzustellen, dass die Form nicht in Kontakt mit einer leitenden Oberfläche ist direktionale Kühlung zu verhindern. Legen Sie die Formen, die die gefrorenen Proben in eine Gefriertrocknungskolben geben. Verbinden der Lyophilisator Kolben zum laboratory Gefriertrocknersystem und für 24 h trocknen. HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Probe vor der Gefriertrocknung eingefroren bleibt. Lagern Sie die gefriergetrockneten Schäume in einem Exsikkator, bis sie benötigt. 3. ECM-abgeleitete Mikrocarrier Fabrication über Elektrospray – Zerstäubung HINWEIS: Eine Übersicht über das Elektrospray eingerichtet ist in Abbildung 2 dargestellt. Inkubiere die gefroren vermahlen ECM Suspension aus Schritt 1.3.13 bei 37 ° C unter kontinuierlichem Rühren bei 100 rpm O / N. HINWEIS: gefroren vermahlen ECM verwendet wird, um die ECM-derived Mikro herzustellen in der Suspension auf eine größere Einheitlichkeit und verhindern Verstopfung bei Elektrosprühen. Last 3 ml ECM Suspension in eine 3 mL Luer-Lock-Spritze und befestigen einen geflügelten Infusionsset auf die Bohrung der Spritze. HINWEIS: Eine Reihe von Nadelstärken verwendet werden kann, zu erkennen, dass die Auswahl der Größe und Form der resultierenden Mikroträger beeinflussen. Um fabricate die DAT, DDT, und DLV Mikrocarriern in einer 25 G Nadel. Sichern der Spritze in der Spritzenpumpe. Befestigen der Nadel an einer Retorte Ständer und Position vertikal um die Nadelspitze in einem Abstand von 4 – 6 cm von der Spitze einer Nieder Form Dewargefäß (250-500 ml Grßenbereich empfohlen). Befestigen einer Krokodilklemme Elektrode an die Spitze der Nadel und verbinden es mit dem positiven Anschluss der Hochspannungsstromversorgung. Falten eines Streifens aus Aluminiumfolie (12 x 5 cm) über die Kante des Vakuumkolben. Befestigen eine zweite Krokodilklemme Elektrode an der Außenkante der Folie und verbindet es mit dem Boden der Source-Anschluss der Stromversorgung. Füllen Sie das Dewar mit flüssigem Stickstoff auf etwa 1 cm von der Spitze, so dass ¾ der Folie eingetaucht ist. HINWEIS: Es ist wichtig, den Dewar mit flüssigem Stickstoff gefüllt zu halten. Die Oberfläche des flüssigen Stickstoffs muß nicht weniger als 2 cm von der Oberseite des Kolbens während der Elektrospray-Vorarbs. Kontinuierliche Nachfüllung des flüssigen Stickstoffs erforderlich, um einen konstanten Pegel zu halten beim Elektrosprühen. Stellen Sie die Spritzenpumpe mit einer Infusionsgeschwindigkeit von 30 ml / h. HINWEIS: Das Variieren der Infusionsrate kann die Mikroträger Form und den Durchmesser verändern, aber der empfohlene Bereich ist 25 – 35 ml / h. Während es in hohem Maße abhängig von der Viskosität der Suspension ist, Durchflussrate unterhalb von 25 ml / h kann bei der Erzeugung von größeren Mikrocarriern führen. Bei sehr niedrigen Strömungsgeschwindigkeiten kann die Größe und Form der Mikro werden weniger homogen. Bei Infusionsraten oberhalb von 35 ml / h, die Gleichförmigkeit der über Elektrosprühen erzeugten Tröpfchen kann aufgebrochen werden, was zu einem nicht kugelförmigen Mikroträgern mit einer breiteren Grßenverteilung 34. Anwenden einer Spannung von 20 kV und schalten den Spritzenpumpe Elektrosprühen zu initiieren. HINWEIS: Die Spannung, die Größe des Mikroträgers abzustimmen variiert werden kann, und neigt dazu, einen größeren Einfluss auf dem Durchmesser als der Infusio hatn Rate. Der empfohlene Spannungsbereich beträgt 15 bis 25 kV. Eine Abnahme des Mikrodurchmesser wird mit einer Zunahme der Spannung 35 erwartet. Sobald die Infusion abgeschlossen ist, sorgfältig überschüssige Flüssigkeit Stickstoff aus dem Dewar, so dass das Mikro suspendiert in ~ 25 ml flüssigen Stickstoff abgießen sie eingefroren bleiben zu gewährleisten. Unmittelbar überträgt die Mikroträger mit dem flüssigen Stickstoff in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen durch in einer gleichmäßigen Bewegung Ausgießen. Sammeln Sie alle gefrorenen Mikro im Dewar restlichen mit einem Spatel und fügen Sie sie in das Zentrifugenröhrchen. HINWEIS: In Abhängigkeit von der Größe des Dewar, können die Mikroträger in flüssigem Stickstoff werden zunächst in eine mittelgroßen Gefäß gegossen, und dann sofort in die 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführt. Decken das Zentrifugenröhrchen die Mikroträger in flüssigem Stickstoff mit einer Aluminiumfolie mit kleinen Löchern perforiert, in Vorbereitung für die Lyophilisation enthält. Legen Sie die bedeckte ZentrifugeRohre in einen Lyophilisator Kolben. Unmittelbar verbinden den Kolben auf dem Lyophilisator und trocknen Proben O / N. HINWEIS: Es ist sehr wichtig, das Mikro in flüssigem Stickstoff suspendiert halten sie vor diesem Schritt nicht auftauen, um sicherzustellen, wie das Auftauen in Kollaps und / oder Aggregation führen kann. DAT, DDT und DLV Mikroträger mit einer Konzentration von 35 mg / ml, hergestellt unter Verwendung der oben beschriebenen Elektrospray-Bedingungen werden typischerweise ein hydratisierten Durchmesser im Bereich zwischen 350 bis 500 & mgr; m groß. Die Größenverteilung variieren kann auf der ECM-Quelle abhängig. Lagern Sie die gefriergetrocknete Mikrocarriern in einem Exsikkator, bis sie benötigt. Abbildung 2. Überblick über die Vorrichtung Elektrospray – Zerstäubung in Mikrocarrier Herstellung verwendet. A: Bild der Anordnung der Tastenelektrospray Ausrüstung einschließlich der Spritzenpumpe zeigt ,und Hochspannungsstromversorgung sowie die Positionierung der Nadel relativ zu dem Dewar mit flüssigem Stickstoff. B: Elektrospray – schematische, einschließlich der empfohlenen Bereiche für die Spannung, die Infusionsrate und Distanz. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 4. Vorbereitung Foams und Mikroträger für die Zellkultur Rehydrierung Überträgt die lyophilisierten Schäume mit einer Pinzette in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen überschüssiges absolutes Ethanols (~ 99,9%) mit einem Gehalt (~ 5: 1 Verhältnis von Ethanol zu Schäumen). In ähnlicher Weise Resuspendieren der lyophilisierten Mikrocarriern in überschüssigem absolutem Ethanol innerhalb der ursprünglichen Zentrifugenröhrchen für die Sammlung verwendet. Verwendung einer serologischen Pipette, Filtern der Mikroträger durch ein rostfreies Sieb mit einer definierten Maschenweite in ein neues 50 ml Zentrifugenröhrchen keine Aggregate zu entfernen, und wählen Sie für die gewünschten Grßenbereiche. HINWEIS: Wenn die Schäume innerhalb TCPS Platten hergestellt werden, können sie direkt in diesen Gefäßen rehydratisiert werden. Inkubieren bei 4 ° C für 4 Stunden oder bis die Schäume oder Mikroträger haben zum Boden des Zentrifugenröhrchens Schwerkraft angesiedelt. Führen alle nachfolgenden Schritte in einer laminaren Strömungshaube unter Verwendung von sterilen Reagenzien und richtige aseptischen Bedingungen. Entfernen Sie die absolute Ethanol eine serologische Pipette und ein Überschuss (5: 1-Verhältnis) 95% igem Ethanol mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) verdünnt, um die Gerüste. Inkubieren bei 4 ° C für 4 Stunden oder bis die ECM-derived Gerüste haben auf den Grund des Behälters Rehydratation versenkt. Schrittweise rehydriert die Gerüste durch eine Ethanolreihe (90, 85, 80, 75, 70, 50, 25 und 0%, verdünnt mit sterilem PBS). Bei jedem Schritt wird bei 4 ° C inkubieren, bis die Gerüste auf den Boden des Behälters abgesunken sind, bevor die Lösung zu verändern. Entgasen der Gerüste unter leichtem Vakuum, wenn die Blasenbildung innerhalb der Gerüste ist observed. Ersetzt die sterile PBS für weitere zwei Spülungen restliches Ethanol zu entfernen. Speicher in 100% steriles PBS bei 4 ° C bis bereit für die Zellkultur. Verwenden Sie die Gerüste innerhalb von 1 bis 2 Wochen nach der Rehydrierung. Vorbereitung für die Zellaussaat Am Tag vor dem Aussäen, übertragen die Schäume Zange in Zellkultur behandelten Well – Platten oder Transwell – Einsätze und fügen ausreichende Zellkulturmedium (ausgewählt auf der Basis der Zelltyp von Interesse) verwendet , um vollständig die Gerüste (zB 2,5 ml / Gerüst unterzutauchen in eine 12-Well-Platte). In ähnlicher Weise ermöglicht der Mikroschwerkraft absetzen innerhalb des Zentrifugenrohrs, sorgfältig die PBS entfernen, um eine serologische Pipette ohne die Mikroträger zu stören, und das Zellkulturmedium hinzuzufügen, ein 5 zu erreichen: 1-Verhältnis von Medium zu den Mikrocarriern. HINWEIS: Für die menschliche ASCS Aussaat verwenden Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM): Ham-F12-Nährstoffmischung, ergänzt mit10% fötales Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin. Ersetzen des Zellkulturmediums für insgesamt eine Spülung. Äquilibrieren die Gerüste über Nacht in Zellkulturmedium bei 37 ° C. Die Gerüste werden für Zelle bereit sein, am nächsten Tag der Aussaat. HINWEIS: Die Schäume können statisch in Zellkultur – Einsätzen oder Gewebekultur – Well – Platten 29, oder dynamisch ausgesät werden ausgesät 36 einen Laborschüttler verwenden. In Abhängigkeit von der ECM Quelle, Verarbeitungsverfahren und Suspensionskonzentration kann dynamische seeding anfängliche Zellanheftung, Proliferation und Infiltration verbessern. Die Mikroträger können mit einem Spinner Kultursystem 11 ausgesät dynamisch werden.

Representative Results

In der vorliegenden Studie haben wir ECM-derived Schaumstoffen und Microcarriern unter Verwendung von menschlichem DAT, porcine DDT und porcine DLV als repräsentative Beispiele hergestellt was zeigt, dass die Techniken angewendet werden können gewebsspezifische bioscaffolds unter Verwendung einer Vielzahl von dezellularisierten Geweben als ECM-Quellen zu erzeugen ( Abbildung 1). Sowohl für die Schaum- und Mikroherstellung, die Nishihara Technik des Kollagens Solubilisierung mit dem glykolytischen Enzyme α-Amylase – 37 war eine viskose ECM Suspension von den dezellularisierten Gewebeausgangsmaterialien zu erzeugen , angepasst, die verwendet wird , um die bioscaffolds durch kontrolliertes Einfrieren und Gefriertrocknungsverfahren zu synthetisieren. Um die Schäume herzustellen können, die dezellularisierten Gewebe entweder durch mechanische Zerkleinerung verarbeitet oder Cryomahlung der Oberfläche vor dem enzymatischen Abbau zu erhöhen. Es folgen45; -Amylase Behandlung und Homogenisieren der resultierende ECM Suspension wird in eine benutzerdefinierte Form abgegeben, die dann eingefroren und lyophilisiert. Die Gerüste können stabil in einem trockenen Zustand über einen längeren Zeitraum gelagert werden. Vor der Verwendung in Zellkulturstudien zu verwenden, müssen die lyophilisierten Gerüste zu einem kontrollierten Rehydratation unterzogen werden , die aus reinem ECM (3A) abgeleitet poröse und hoch hydratisierte homogene Schäume ergeben. Wenn die Schäume zu schnell rehydratisiert werden, kann eine schnelle Anschwellen empfindliche Strukturmerkmale beschädigen, was zu einem Verlust der Integrität und strukturellen Kollaps. Im Allgemeinen wird behalten die Schäume, die Form durch die ursprüngliche Form folgende Rehydrierung definiert und stabil sind, ohne dass eine chemische Vernetzung. 3B zeigt repräsentative Rasterelektronenmikroskops (SEM) -Bilder des DAT, DDT, und Schäume, die mit DLV gefroren vermahlen ECM in einer Konzentration von 35 mg / ml und eine Einfriertemperatur von -80 & # gefertigt176; C. Abbildung 3. Repräsentative Bilder des DAT, DDT, und DLV Foams Fabricated mit gefroren vermahlen ECM Suspensionen bei einer Konzentration von 35 mg / ml und gefriert bei -80 ° C. A: Makroskopische Ansicht des DAT, DDT, und DLV Schäume gefrästen folgenden Rehydratation in einer Kulturplatte mit 48 Vertiefungen Formgewebe synthetisiert. Skalenbalken stellen 1 cm. B: REM – Bilder der DAT, DDT, und DLV Schäume eine homogene poröse Ultrastruktur zeigt. Maßstabsbalken entspricht 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Die gefroren vermahlen ECM Suspensionen können auch Mikroträger über Elektrospray – Techniken (Abbildung 2 zu erzeugen reinen ECM-derived verwendet werden , </strOng>). Für jede ECM Quelle, die Suspensionskonzentration, Nadelabstand, Infusionsrate und Spannung kann eingestellt werden diskrete kugelförmige Microcarriern von 350 bis hin zu erzeugen , – 500 um Durchmesser folgende kontrollierte Rehydratation (4A). Während die Mikroträger können in einem lyophilisierten Zustand gelagert werden, ist es für eine einfache Handhabung empfohlen, dass sie zu einem gewünschten Grßenbereich folgenden Resuspension in Ethanol verzichtet oder gesiebt. SEM – Bildgebung legt nahe , daß die Mikroträger in Abhängigkeit von der Ultrastruktur dezellularisierten Gewebequelle variieren kann (4B). Abbildung 4. Repräsentative Bilder des DAT, DDT, und DLV Mikroträger mit Fabricated gefriert vermahlen ECM Suspensionen bei einer Konzentration von 35 mg / ml, eine Infusionsrate von 0,5 ml / min und einer angelegten Spannung von 20 kV. A: Die makroskopische Ansicht of den hydratisierten DAT, DDT, und DLV Mikroträger. Maßstabsbalken repräsentieren 4 mm. B: REM – Bilder der DAT, DDT, und DLV Mikroträger zeigen , dass die Ultrastruktur und Größe variieren können auf der ECM Quelle abhängig. Maßstabsbalken entspricht 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Die mechanischen Eigenschaften der Gerüste auf der ECM Quelle abhängig sind, angewendet das Verfahren der Verarbeitung (dh gegenüber Kryomahlen Zerhacken), die ECM Suspensionskonzentration und die Gefriertemperatur. Im Allgemeinen ist die Gerüste sind weich und nachgiebig, mit Young-Module im Bereich von 1 bis 5 kPa berichteten für das DAT (50 & 100 mg / ml) 29 und DLV – Schaumstoffe (20-50 mg / ml) 31 und <1 kPa für die Mikroträger. Die gefroren vermahlen Schäume sind in der Regel weicher theine der zerkleinerten Schäume aufgrund ihrer mehr gestört Natur. Specialized mechanischen Prüfsystemen mit hochempfindlichen Lastzellen werden für eine genaue Charakterisierung der Druckeigenschaften erforderlich. Typischerweise würden die Schäume und Mikro haben niedrigere Module als die nativen dezellularisierten Gewebe aufgrund der zusätzlichen Verarbeitungsschritte bei der Herstellung einschließlich enzymatischer Verdauung und Homogenisierung beteiligt ist, sowie die nicht-kovalent vernetzte Natur der Gerüste. Dies kann jedoch in Abhängigkeit von dem Gewebe von Interesse variiert. Zum Beispiel in früheren Arbeiten fanden wir , dass gehacktes DAT bei hohen Konzentrationen ECM hergestellt Schaumstoffe (100 mg / ml) hatte ähnliche Module zu nativem Fettgewebe 29. Der rehydratisierten ECM-derived Schaumstoffen und Microcarriern können mit Zellen unter statischen oder dynamischen Kulturbedingungen ausgesät werden , um eine Zelle stützende Plattform für die in – vitro – Zellkulturstudien und / or in vivo Zellabgabe. Während die Gerüste im Allgemeinen Zellanheftung unterstützen, wird die Impfeffizienz auf der ECM-Quelle abhängen, das Gerüst Geometrie und Porosität und den Zelltyp von Interesse. Als solche werden die Aussaat Methoden und Dichten erfordern Optimierung in Abhängigkeit von den vom Benutzer definierten Bedingungen. Für die Schäume oben beschrieben ist , empfehle ich eine Anfangszellkonzentration im Bereich von 0,25 bis 1 x 10 6 Zellen / Gerüst, mit dynamischem seeding auf einem Orbitalschüttler Zellinfiltration zu verbessern. Für die Microcarriern, schlagen wir eine anfängliche Aussaatdichte im Bereich von 25.000 – 50.000 Zellen / mg Mikroträger mit Animpfen unter dynamischen Bedingungen in einer Spinner – Kultur – Kolbe 11 durchgeführt. Die Bilder an der Unterseite der Figur 1 gezeigten darstellen menschliche ASCs auf einem DAT – Schaum ausgesät (links) oder DAT – Mikroträger (rechts, vormarkiert mit einem Amin-reaktiven Farbstoff und Blau 13 erscheinen), wie durch konfokale Mikro visualisiertscopy unter Verwendung einer fluoreszierenden Lebensfähigkeit der Zellen-Färbung (lebende Zellen = grün, tote Zellen = rot; Maßstabsbalken entspricht 100 & mgr; m). Konfokalmikroskopie können verwendet werden, um Zellen auf der Oberfläche der Schäume bis zu 2 mm Dicke ausgesät zu visualisieren, sondern Visualisierung in den zentralen Bereichen der Gerüste durch ihre Undurchsichtigkeit begrenzt. Jedoch können die Schäume und Microcarriern werden, wie Gewebe behandelt und in Paraffin eingebettet oder Kryo-geschnitten für eine histologische und immunhistochemische Analysen Zellverteilung und Marker-Expression zu visualisieren.

Discussion

Im Allgemeinen von dezellularisierten Geweben stammten bioscaffolds mehr kann eng approximieren die komplexe 3D-Zusammensetzung und die Struktur der ECM in der nativen zellulären Mikroumgebung im Vergleich zu synthetischen Gerüsten oder Standard-Kulturmodellen basierend auf 2D TCPS. Wie zuvor diskutiert, sind Zell-ECM – Wechselwirkungen kritisch wichtig in Zellverhalten zu vermitteln sowohl in Kultur als auch in dem Körper ^1. Erkenntnis, dass die biochemischen, biophysikalische und biomechanische Eigenschaften des ECM zu jedem Gewebe einzigartig sind, gibt es immer mehr Beweise, um die Gründe für die Anwendung gewebespezifische Ansätze bei der Gestaltung von Biomaterialien für das Tissue Engineering sowie in der Entwicklung von mehr zu unterstützen physiologisch relevante Kulturmodelle für de – vitro – Experimente ^20. Verwendung dezellularisiertes Gewebe als Ausgangsmaterial, unser Verfahren können innerhalb mehr cust die komplexe Zusammensetzung des gewebespezifischen ECM einzuarbeitenomizable Gerüst-Formate. Während die mechanischen und enzymatische Verfahrensschritte in einem Verlust der nativen ECM Ultrastruktur führen, mit DAT Früheren Studien haben gezeigt, dass die instruktiven Effekte des aus Fettgewebe abgeleiteten ECM in diesem Gerüst Formaten konserviert sind, was darauf hindeutet, dass die biologische Gerüst Zusammensetzung ein Schlüsselmediator die Zellfunktion ^{^11,} ^29. Ein wesentlicher Vorteil des ECM-derived Schaumstoffen und Microcarriern als Zellkultursubstrate zur Verwendung in Bezug auf die intakten dezellularisierte Gewebe im Vergleich ist, dass sie homogen sind, die Gleichförmigkeit der Zellverteilung verbessern und die Zell-Zell / Zell-ECM-Wechselwirkungen.

Die hier beschriebenen Methoden können ein breites Spektrum von gewebespezifischen bioscaffolds für den Einsatz in der Zellkultur und Gewebe-Engineering-Anwendungen zu erzeugen, verwendet werden. Zum Beispiel, zusätzlich zu dem DAT, DDT und DLV hat sich unser Labor erfolgreich angewendet, diese Techniken 3D por zu erzeugenous Schaumstoffen dezellularisierten Knochen-, Knorpel-, Nucleus pulposus und Anulus fibrosus sowie im Handel erhältlichen, unlöslichen Kollagen, abgeleitet von Rindersehne verwendet. Von einer in vitro Perspektive könnte diese bioscaffolds als Grundlage für höhere-fidelity 3D Kulturmodelle für die Untersuchung der Zellbiologie, Physiologie oder Krankheitspathologie ^38, als bioaktive Substrate in Hochdurchsatz – Wirkstoff – Screening – Plattformen ^39, oder als instruktiv Matrices für Stamm verwendet werden , Zelldifferenzierung ^{^40,} ^41. DAT, DDT und DLV Schäume bei Konzentrationen hergestellt von 25 – 50 mg / ml sind stabil bei Langzeit – in vitro – Kultur (getestet bis zu 28 Tagen). (- 15 Umdrehungen pro Minute 10) für mindestens 2 Wochen Ferner können alle drei Arten von Mikrocarriern Zellanheftung und die Proliferation unter dynamischen Bedingungen in einem Niedrigscher spinner Kultursystem unterstützen. Für die in vivo – Anwendungen, die biokompatibel und biodegradable ECM-abgeleitete Schäume und Mikro halten Versprechen als off-the-shelf – Produkte ¹¹ konstruktiven Gewebeumbau und Regeneration zu ^stimulieren, ^29. Ferner könnten die zelladhäsiven Gerüste als Zelltherapieverabreichungssysteme ^{^42,} ⁴³ verwendet werden. Als Beispiel wurden DAT Schäume Angiogenese und Adipogenese , wenn sie mit allogenen ASCS und subkutan implantiert in einem immunkompetenten Rattenmodell ²⁹ ausgesät fördern gezeigt. Bezogen auf die intakte DAT, desto höher verarbeitete DAT-Schaumstoffen verschlechtert viel schneller, mit einer 50% igen Reduktion des Volumens an 3 Wochen festgestellt, wie sie mit den Wirtsgewebe integriert wurde und fast vollständige Resorption von 12 Wochen. Aber auch die Schäume eine potentere angiogene Reaktion induziert, was darauf hindeutet, dass das Enzym verdaute ECM einzigartige Pro-regenerierende Wirkung hatte. Ähnlich sind die ECM-derived Mikro als in vitro verwendet werden könnten </ em> Zellkultur – Substrate innerhalb von dynamischen Kultursystemen und als injizierbare Zellabgabeträger ^{^11,} ^{^30,} ^44. Genauer gesagt, der kleine Durchmesser und die große Oberfläche der Mikroträger könnte die Lieferung einer großen Menge von Zellen in einem kleinen Volumen, während eine Matrix ermöglichen , vorausgesetzt, Zellretention an der Stelle ³⁰ die Injektion können helfen , die Lebensfähigkeit der Zellen zu unterstützen und erhöhen. Vor der Verwendung in jedem lebenden System zu verwenden, ist es entscheidend , dass die Source ECM – frei ist im Wesentlichen von antigen zellulären Komponenten zu gewährleisten und / oder potentiell zytotoxischer Dezellularisierung Reagenzien , die eine negative Wirtsantwort ⁷ auslösen könnte.

Das proteolytische Enzym Pepsin ist allgemein bei der Herstellung von ECM-abgeleiteten Hydrogelen ¹⁵ verwendet. Pepsin ist eine nicht-spezifische Protease, die Proteine Kollagen und andere ECM verdauen into kleine Fragmente ^45. Während Hydrogele aus Pepsin verdautem ECM hergestellt wurden berichtet zell instruktiv Auswirkungen haben, ist eine Einschränkung , dass diese Materialien extrem mechanisch schwach ⁴⁶ zu neigen. In unserer ersten Entwicklung des DAT Microcarriern, verwenden wir einen zusammengesetzten Ansatz , bei dem Pepsin verdaute DAT wurde mit Alginat kombiniert und tropfenweise in _CaCI2 ³⁰ sphärische Kügelchen zu bilden. Die Kügelchen wurden anschließend photovernetzte und das Alginat wurde mit Natriumcitrat extrahiert. Neben der Forderung nach einer chemischen Vernetzung, war eine Schlüssel Einschränkung , dass die mit diesem Ansatz hergestellt Microcarriern geringe Stabilität unter einem Größenbereich von 900 hatte – 950 & mgr; m ^30. Anstelle von Pepsin, präsentiert die Methoden hier verwenden, um eine mildere Verdauung des ECM mit dem glykolytischen Enzym α-Amylase, die Kohlenhydratgruppen aus dem telope zu spalten postuliertptide Regionen von Kollagen, wodurch die Löslichkeit in Essigsäure Erhöhung ^37. Dieser Ansatz ermöglicht die Isolierung von hoch polymerisiertem Kollagen, die verwendet werden können, reinen ECM-derived Schaumstoffen und Microcarriern, ohne die Notwendigkeit für eine chemische Vernetzung oder andere Zusätze zu erzeugen. Diese bioscaffolds werden stabilisiert durch physikalische Wechselwirkungen und Wasserstoffbrückenbindung zwischen gut erhaltenen Kollagenfibrillen, ähnlich zu dem Kollagen in der nativen ECM-Mikroumgebung.

Die Schäume sind eine sehr flexible Plattform, die auf der spezifischen Form in einer Vielzahl von Geometrien hergestellt werden kann, in Abhängigkeit davon ausgewählt. Für die Zellkultur-Studien können die Schäume direkt in TCPS-Well-Platten gegossen werden, um Beschichtungen oder 3D-Gerüste zu bilden unterschiedlicher Dicke. Um 3D-Schäume mit sehr gleichmäßigen Oberflächen herzustellen, empfiehlt es sich, eine eigene Form ist so konzipiert, dass mit Kunststoff- oder Glasträger beidseitig abgedichtet werden kann. Entweder fein zerkleinert oder gefroren vermahlen ECM kann verwendet werden, zu synthetisierendie Schäume. Im Allgemeinen haben wir festgestellt , dass die gefroren vermahlen Schäume neigen dazu , einen mehr gestört Ultra bei niedrigeren Konzentrationen ^{^31,} ³⁶ makroskopisch weichen und haben zu sein. Je nach Gewebequelle können die zusätzlichen mechanischen Verarbeitungsschritte führen zu Veränderungen in der ECM-Zusammensetzung, die Zellfunktion beeinflussen können. Zum Beispiel in unserer früheren Arbeit wurde Laminin in gehacktem DLV Schäumen erkannt, aber nicht gefroren vermahlen DLV ³¹ schäumt. Im Gegensatz dazu, Kollagen I, Kollagen IV, Laminin und Fibronectin wurden sowohl in gehacktem detektiert und gefroren vermahlen DAT ³⁶ Schaumstoffen. Zusätzlich zu den mechanischen Verarbeitungsschritten kann die Porosität und die Porengröße der Schäume zu einem gewissen Grad durch die ECM Suspensionskonzentration und die Gefriertemperatur Variieren ⁴⁷ abgestimmt werden. Im Allgemeinen niedrigere Konzentration Schäume (~ 10 bis 15 mg / ml) sind qualitativ poröser, können aber schnell zusammenziehen und haben schlechteStabilität im Langzeitkultur ^{^31,} ^36. Ähnlich ist ein langsamer Gefrierrate, die typischerweise durch eine höhere Gefriertemperatur erreicht wird , kann in größeren Poren in den Schäumen führen , aufgrund der Größe der Eiskristalle bei der Herstellung ²⁹ gebildet. Alle diese Parameter mit den Materialien beeinflussen Zell-Interaktionen, einschließlich Anhang, Infiltration und Umbau. Zum Beispiel kann das Zellwachstum auf Schäume , die mit höheren Konzentrationen ECM hergestellt werden , kann auf die Oberflächenbereiche begrenzt sein, insbesondere mit gehackten ECM – Quellen und unter statischen Kulturbedingungen ^36.

Für die Microcarriern, dass der Schlüsselparameter eingestellt werden kann, ist die ECM Suspensionskonzentration, Nadelabstand, und die angelegte Spannung, mit höheren Konzentrationen Microcarriern typischerweise ergeben, die stabilen unter langfristiger dynamischer Kultur. Nach Aufnahme des Elektrosprays, die ECM suspensIonen Tröpfchen sollte in der Mitte des Kolbens schnell fallen, in die Richtung der Aluminiumfolie Kollektors. Um zu verhindern, Aggregation, ist es wichtig, dass die Perlen, die mit flüssigem Stickstoff auf die Folie vor Kontakt. Der Abstand zwischen der Nadel und der Oberfläche des flüssigen Stickstoffs kann diese Anforderungen gerecht angepasst. Es ist wichtig, dass die Optimierung zu beachten, kann in Abhängigkeit von den Eigenschaften der jeweiligen spezifischen ECM Quelle erforderlich sein, insbesondere in den Konzentrationsbereich auswählen, die stabile bioscaffolds generieren. Ein weiterer Schlüsselfaktor ist die Dezellularisierung Protokoll , das verwendet wird , um die Ausgangsmaterialien zu erzeugen, wie Dezellularisierung Methoden, die die ECM oder die Anwesenheit von restlichen Reagenzien (beispielsweise Surfactants) verschlechtern kann sich negativ auf die Stabilität der resultierenden Schäume und Microcarriern auswirken. Wenn Herausforderungen mit biologischer Gerüst Stabilität, Optionen begegnet, die unter Verwendung eines allmählichen Rehydratisierungsprozess untersucht werden kann, die Erhöhung die ECM suspension Konzentration, und im Vergleich zu gefroren vermahlen ECM gehackten Exploring. Sollten alle diese Optionen nicht das Problem zu beheben, kann es notwendig sein, alternative Dezellularisierung Protokolle oder ECM Quellen zu erkunden.

Um sicherzustellen, Reproduzierbarkeit während Gerüst Produktion muss besondere Sorgfalt bei bestimmten Schritten in das Protokoll aufgenommen werden. Wenn das dezellularisierte Gewebe Kryomahlen, empfiehlt es sich, Fräsen sofort in einer trockenen Umgebung nach der Lyophilisierung durchgeführt werden, um die Wahrscheinlichkeit der Teilchenaggregation zu reduzieren aufgrund der Absorption von Feuchtigkeit aus der Umgebung. Während der Mikroherstellung, wird vorgeschlagen, dass die Suspension in kleinen Chargen elektrogesprüht wird, mit einem maximalen Volumen von 3 ml, zu vermeiden Problemen mit der Probenkühlung, die in einem Verstopfen der Nadel führen kann. Ferner ist es wichtig, dass das Mikro nicht nach den Elektrospray-Verfahren zu aufzutauen ist erlaubt. Um ihre kugelförmige Geometrie und mechanische Stabilität zu erhalten, die microcarriERS sollte in einem mit flüssigem Stickstoff gefüllten Behältern, und sofort gefriergetrocknet aus dem flüssigen Stickstoff, transportiert gesammelt werden. Schließlich sowohl für die Schäume und Microcarriern, ist es entscheidend, dass die Rehydrierung Schritte langsam über einen Zeitraum von mehreren Tagen durchgeführt werden. Schnelle Rehydrierung kann in strukturellen Kollaps auf der Makro- und / oder Mikromaßstab führen. Rehydratisierung muss Ferner treten langsam die Bildung von kleinen Luftblasen innerhalb des Gerüstes zu verhindern, welche eine erhebliche Menge an Zeit zum Entgasen unter leichtem Vakuum erfordern kann.

Abschließend können die Verfahren die in diesem Papier verwendet werden, um eine Vielfalt von gewebsspezifischen Schaumstoffen und Microcarriern der reinen, nicht-chemisch vernetzten ECM umfasst herzustellen. Ein Vorteil für biologische Forscher ist, dass die bioscaffolds leicht zu handhaben und kann in ähnlicher Weise zu Geweben verarbeitet werden, wenn Analysen mit Techniken wie der Histologie, Immunhistochemie oder Gen- und Proteinexpressionsassays durchgeführt wird.Zusätzlich kann das ECM-derived Gerüsten enzymatisch abgebaut werden beimpften Zellpopulationen zu extrahieren, oder kann direkt als biologisch abbaubare und biokompatible Zellabgabevehikel verwendet werden. Insgesamt hält diese flexible Plattform-Technologie von großem Nutzen für zahlreiche Anwendungen, darunter für die 3D-Zellkulturstudien Zellfunktion zu untersuchen, wie die Zellexpansion Substrate und als Pro-regenerative bioscaffolds.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada and the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) have provided funding for this work. The authors would like to acknowledge Dr. Amin Rizkalla for the use of his electrospraying system, the Nanofabrication Facility at Western University for use of SEM imaging equipment, the Mount Brydges Abattoir for the provision of porcine tissue samples, and Drs. Aaron Grant, Brian Evans, and Robert Richards for their clinical collaborations in support of this research.

Materials

Acetic acid, glacial	BioShop	ACE222.500
Alligator clip leads	VWR	470149-728
Aluminium foil	Fisher Scientific	01-213-101
a-amylase	Sigma	101074694	from Aspergillus aryzae
Analytical balance	Sartorius	CPA225D
Centrifuge	Thermo Scientific	75004251	With swinging bucket rotor for 15 and 50 mL centrifuge tubes
Centrifuge tubes (15 mL)	Sarstedt	62.554.205
Centrifuge tubes (50 mL)	Sarstedt	62.547.205
Collagen from bovine achilles tendon (insoluble)	Sigma	C9879	Or similar insoluble collagen source; Can be used as an alternative to decellularized tissues to fabricate the foams and microcarriers
Cryomilling system	Retsch	20.745.0001	MM 400
Dessicator	Fisher Scientific	8624426	For lyophilized ECM and bioscaffold storage
DMEM: F12 Hams	Sigma	D6421	Used for proliferation media
Dewar flask	Fisher Scientific	10-196-6	Low form; volume range of 250 – 500 mL
Double distilled water			From Barnstead GenPure xCAD Water Purification System
D-PBS	Wisent	311425125
ECM			Isolated from human adipose tissue, porcine dermis or porcine myocardium, as described in Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010, and Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32)
Ethanol	Greenfield Specialty Alcohols Inc.	P016EAAN	Absolute
Fetal bovine serum	Wisent	80150	Used for proliferation media
Forceps	VWR	37-501-32	For transferring the foams
Freezer (-20 °C)	VWR	97043-346
Freezer ( -80 °C)	Thermo Scientific	EXF40086A
Glass vials	Fisher Scientific	03-339-26D	To store lyophilized cryomilled ECM
Hand held homogenizer	Fisher Scientific	14-359-251	Speed: 8000 – 30,000 RPM
Homogenizer accessories: saw tooth bottom generator probes	Fisher Scientific	14-261-17	10 X 95 mm
Liquid nitrogen			For electrospraying
Lyophilizer	Labconco	7750021	FreeZone4.5
Milling chamber	Retsch	02.462.0213	25 mL volume recommended
Milling balls	VWR	16003-606	10 mm diameter, stainless steel recommended
18G needle	VWR	C ABD305185	For dispensing ECM suspension into moulds
Orbital incubator shaker	SciLogex	832010089999	Temperature controlled (37 °C)
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140-122	Used for proliferation media
Pipet-Aid XP	Mandel Scientific	DRU-4-000-101
Retort stand	VWR	470019-526
Retort stand clamp	VWR	21573-606
Safety-Lok Syringe	BD	309606	3 mL luer lock syringe for microcarrier fabrication and dispensing ECM suspension
Serological pipettes (10 mL )	Sarstedt	86.1254.001
Serological pipettes (25 mL)	Sarstedt	86.1685.001
Sodium chloride	BioShop	7647-14-5
Sodium phosphate monobasic	BioShop	10049-21-5
Scoopula	VWR	89259-968	For collecting microcarriers
Surgical scissors	VWR	82027-590
Syringe pump	VWR	10117-490	Microprocessor controlled
High voltage power supply	Gamma High Voltage Research	ES30P-5W/DDPM	Capable of recommended 15 – 25 kV voltage range
12-well plates	Fisher Scientific	12565321	For use as molds during foam fabrication; Other sizes or user-defined molds can also be selected
Winged infusion set	Terumo	22258092	30 cm tubing length, 25 G 3/4 " recommended; Other needle gauges can be used and may influence microcarrier diameter

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Kornmuller, A., Brown, C. F., Yu, C., Flynn, L. E. Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms. J. Vis. Exp. (122), e55436, doi:10.3791/55436 (2017).