تصنيع كسوات وناقل دقيق مستمد مصفوفة خارج الخلية حيث الثقافة خلية الأنسجة محددة ومنصات التوصيل
Summary
المصفوفة خارج الخلية الأنسجة محددة (ECM) هو الوسيط الرئيسي من وظيفة الخلية. توضح هذه المقالة طرق توليف الرغاوي وناقل دقيق التي هي مستقرة بالثقافة بدون حاجة إلى يشابك الكيميائي لتقديم الطلبات في 3D متقدم في نماذج زراعة الخلايا المختبر أو bioscaffolds الموالية لالتجديدي المستمدة ECM الخالص.
Abstract
وتوسطت وظيفة الخلية عن طريق التفاعل مع المصفوفة خارج الخلية (ECM)، التي لديها تركيبة معقدة الأنسجة محددة والهندسة المعمارية. وتركز هذه المقالة على طرق تصنيع المواد الرغوية وناقل دقيق مسامية المستمدة ECM لاستخدامها بوصفها ركائز البيولوجية ذات الصلة في 3D المتقدمة في نماذج زراعة الخلايا في المختبر أو السقالات الموالية للالتجدد وأنظمة تسليم خلية للهندسة الأنسجة والطب التجديدي. باستخدام الأنسجة decellularized أو الكولاجين غير قابلة للذوبان المنقى كمادة البداية، يمكن تطبيق تقنيات لتجميع مجموعة واسعة من bioscaffolds الأنسجة محددة مع هندستها للتخصيص. ينطوي على نهج المعالجة الميكانيكية والأنزيمية الهضم خفيفة الى تسفر عن تعليق ECM التي تستخدم لتصنيع الرغاوي ثلاثية الأبعاد أو ناقل دقيق من خلال إجراءات تجميد وبالتجفيد التي تسيطر عليها. هذه السقالات المستمدة ECM النقية هي التي يسهل اختراقها للغاية، ولكن مستقرة دون الحاجة إلى كيميائيآل يشابك وكلاء أو غيرها من المواد المضافة التي قد تؤثر سلبا على وظيفة الخلية. خصائص سقالة يمكن ضبطها إلى حد ما بفعل عوامل مختلفة مثل تركيز ECM تعليق، وأساليب المعالجة الميكانيكية، أو الظروف التوليف. بشكل عام، السقالات هي قوية وسهلة للتعامل، ويمكن معالجتها كما أنسجة لمعظم المقايسات البيولوجية القياسية، وتوفير منصة الثقافة 3D خلية تنوعا وسهلة الاستعمال الذي يحاكي تكوين ECM الأصلي. وعموما، قد تكون هذه الأساليب واضحة لافتعال الرغاوي وناقل دقيق المستمدة ECM مخصصة التي تهم كلا البيولوجيين والمهندسين الطبية الحيوية كمنصات خلايا مفيدة الأنسجة محددة لفي المختبر وفي التطبيقات الجسم الحي.
Introduction
وتتألف المصفوفة خارج الخلية (ECM) من شبكة معقدة 3D من البروتينات وبروتينات سكرية، والسكريات 1. مرة واحدة تعتبر إطارا في الغالب الهيكلي، ومن المسلم به الآن جيدا أن ECM يتضمن مجموعة متنوعة من الجزيئات النشطة بيولوجيا مع أدوار وظيفية هامة 2. التفاعلات خلية ECM يمكن توجيه بقاء الخلية، التصاق، والهجرة، والانتشار، والتمايز 3. في حين أن فئات رئيسية من الجزيئات ECM عموما المحفوظة بشكل جيد عبر الأنسجة والأنواع، كل الأنسجة لديها تكوين مصفوفة فريدة من نوعها والهندسة المعمارية (4). وعموما، يوفر ECM الأنسجة محددة لالمكروية مفيدة التي تتوسط ظيفة من دوين الخلوي لحجم الأنسجة / الجهاز 5.
نظرا للدور الحاسم من ECM في التوسط وظيفة الخلوية، كان هناك اهتمام متزايد في ديvelopment من bioscaffolds المستمدة ECM للتطبيقات في هندسة الأنسجة والطب التجديدي. على وجه الخصوص، وقد تم اكتشاف طريقة decellularization على نطاق واسع كوسيلة للحصول على ECM من مجموعة واسعة من الأنسجة لاستخدامها كمادة سقالات للتجديد الأنسجة والخلايا تسليم 5 و 6 و 7. Decellularization عادة ما ينطوي على سلسلة من والكيميائية وأو مراحل المعالجة الميكانيكية / البيولوجية التي تستهدف إزالة الخلايا والمكونات الخلوية، بينما تسبب مثالي الحد الأدنى من تعديلات على هيكل 3D وتكوين ECM 8. من خلال مسح الأدب، ويمكن التعرف على بروتوكولات decellularization مختلف عن كل الأنسجة تقريبا في الجسم 7.
بينما الأنسجة decellularized يمكن استخدامها مباشرة كما السقالات زرع أو 3D ركائز ثقافة الخلية، قد تسلل الخلويةتكون محدودة في الأنسجة مع هيكل ECM كثيفة 9. وعلاوة على ذلك، فإن عدم التجانس الطبيعي في ECM قد يسبب تقلبات في مرفق الخلية والتوزيع ضمن مصفوفات decellularized، والتي من المحتمل أن تؤثر على الاستجابة الخلوية 10. وبشكل عام، في حين واعدة بالنسبة لبعض التطبيقات، تطبيق الأنسجة decellularized في شكلها سليمة توفر التنوع المحدود من حيث الخصائص ضبط سقالة بما في ذلك الشكل، المسامية، وصلابة، فضلا عن طريقة التسليم للتطبيقات في الجسم الحي.
وللتغلب على هذه القيود، مجموعات بحثية عديدة تطبق أساليب معالجة أخرى لتوليد صيغ سقالة مخصصة باستخدام الأنسجة decellularized كمادة قاعدة. في أبسط صوره، وهذا قد تنطوي على cryomilling الأنسجة decellularized لتوليد حقن جزيئات ECM الأنسجة محددة 11. يمكن إدراج هذه الجزيئات ECM بمثابة خلية instruعنصر التفاعلية الذي نظمه في السقالات المركبة مع المواد الحيوية الأخرى، مثل في الموقع يشابك الهلاميات 12 و 13 و 14. بالإضافة إلى المعالجة الميكانيكية، ويمكن أيضا الأنسجة decellularized أن تخضع لعملية الهضم الأنزيمي مع بروتين و / أو الانزيمات حال السكر لصنع الهلاميات المائية المستمدة ECM والمواد الرغوية، ناقل دقيق، والطلاء 15 و 16 و 17، وكذلك لتجميع bioinks للطباعة 3D 18.
بالإضافة إلى التطبيقات الأنسجة والهندسة، وعقد bioscaffolds المستمدة ECM إمكانات كبيرة لتوليد أعلى الإخلاص نماذج في المختبر للبحث البيولوجي. وهناك حاجة كبيرة لتطوير أنظمة زراعة الخلايا 3D أن ألخص أفضل المكروية الخلوية المحلية 19. الأكثر في المختبر جوتجرى دراسات ثقافة الذراع حتى الآن على زراعة الأنسجة البوليسترين (برنامج التعاون الفني)، الذي لديه علاقة تذكر مع الوسط الخلوي معقد من الناحية البيولوجية والحيوية وجدت داخل الأنسجة الحية 20. بينما ملائمة لدراسة التفاعلات الخلوية في بيئة تسيطر عليها، وزراعة الخلايا على هذه ركائز 2D جامدة مبسطة يغير مرفق الخلية والتشكل، وكذلك كل خلية خلية وخلية ECM التفاعلات 21 و 22. التعديلات الخلوية لوحظ على 2D برامج التعاون الفني يمكن أن تؤثر على مسارات الإشارات بين الخلايا التي تنظم وظائف الخلية المتنوعة بما في ذلك البقاء على قيد الحياة، وانتشار، والهجرة، والتمايز، مما يثير تساؤلات من أهمية الدراسات 2D في النمذجة في أنظمة الجسم الحي 23. وكان هناك اعتراف متزايد بأن السلوك الخلوي يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا في 2D مقابل النظم 3D 24، والتي البيوكيميائية ونصفيشير omechanical مع ECM هي الوسطاء الرئيسيين من وظيفة الخلية 25. وقد حاول العديد من الجماعات للتغلب على القيود المفروضة على أنظمة 2D التي وضعتها طلاء برامج التعاون الفني مع مكونات ECM مثل الكولاجين، laminin وفبرونيكتين. في حين أن هذه الاستراتيجيات يمكن أن تحسن مرفق الخلية وقد تغير الاستجابات الخلوية، وهذه النماذج لا تزال محدودة بسبب التكوين 2D على أن لا تحاكي التنظيم المكاني معقدة أو الكيمياء الحيوية من ECM الأصلي 26 و 27.
لقد كان لدينا مختبر الهندسة الحيوية مهتمة في تطوير bioscaffolds المستمدة ECM بمثابة ركائز لتطبيقات زراعة الخلايا والأنسجة الهندسة 3-D. على وجه الخصوص، ونحن كان لها السبق في استخدام الأنسجة الدهنية decellularized (DAT) كمنصة سقالات للالدهنية تجديد 28. وعلاوة على ذلك، أنشأنا طرق تجميع ناقل دقيق 3D والرغاوي التي يسهل اختراقها باستخدام DAT هضمها مع البيبسين انزيم بروتين أو أنزيم الأميليز حال السكر α-29 و 30 و 31. وتجدر الإشارة إلى أننا أثبتنا في كل من هذه الأشكال سقالة أن يوفر ECM الدهنية المشتقة من المكروية الاستقرائي للتمايز مكون الشحم من الخلايا البشرية الدهنية المشتقة الجذعية / اللحمية (مخولا لصيانة طائرات) في الثقافة. وفي الآونة الأخيرة، وسعنا أساليب التصنيع لدينا لتوليد 3D الرغاوي التي يسهل اختراقها من الخنازير هضمها α الأميليز-decellularized البطين الأيسر (DLV) (طرق decellularization مقتبس من ينرايت وآخرون. 32)، وأظهرت أنها توفر منصة داعمة لإحداث cardiomyogenic في وقت مبكر التعبير علامة في التامور مخولا لصيانة طائرات المشتقة من الدهون الإنسان 31.
توضح هذه المقالة بالتفصيل الطرق لتوليف غير كيميائيا عبر ربط 3D الرغاوي وناقل دقيق مسامية المستمدة بحتةمن ECM α الأميليز هضم لاستخدامها 3D معقدة بيولوجيا في ركائز الثقافة خلية المختبر وكما الحيوية لتجديد الأنسجة. من الناحية النظرية، أي مصدر ECM التي تحتوي على ارتفاع الوزن الجزيئي الكولاجين يمكن أن تستخدم كمادة انطلاق لهذه التقنيات. إلى إبداء المرونة لهذا النهج، وقد تم تطبيق أساليب لتوليد bioscaffolds الأنسجة محددة باستخدام DAT البشري، الخنزير decellularized الجلد الأنسجة (DDT) 8، والخنازير DLV كأمثلة التمثيلية. ويقدم الشكل 1 لمحة بصرية من عملية تصنيع لرغاوي وناقل دقيق المستمدة ECM.
الشكل 1. نظرة عامة على طريقة لإنتاج الرغاوي وناقل دقيق المستمدة ECM-الأنسجة محددة. decel 1. الأنسجة Decellularized، أعدت في أعقاب تأسيسبروتوكولات lularization، ويمكن استخدامها لأنسجة محددة المستمدة ECM bioscaffold تلفيق. وتظهر الصور العيانية من DAT البشري رطب (أعد كما هو موضح في فلين 2010 28)، DDT الخنازير (أعد كما هو موضح في Reing، JE، وآخرون. 2010 8)، والخنازير DLV (أعد كما هو موضح في ينرايت وآخرون. 2010 32 )، والأمثلة النموذجية على مصادر ECM التي يمكن استخدامها كمواد البداية. تمثل القضبان نطاق 3 سم. 2. يتم مجفف بالتجميد أنسجة decellularized، ثم 3. مفروم ميكانيكيا. تمثل الحانات مقياس 1 سم. 4. ويمكن بعد ذلك cryomilled وECM المفروم، الذي هو اختياري للرغوة تلفيق، ولكن المطلوب لتخليق ناقل دقيق. يمثل مقياس شريط 3 مم. 5. ثم يتم هضمها وECM مفروم أو cryomilled مع α الأميليز والمتجانس لإنشاء تعليق ECM متجانسة. يمثل مقياس شريط 1 سم. <strأونج> 6A) لرغوة تلفيق، يتم نقل تعليق ECM إلى المعرفة العفن، والمجمدة، ومجفف بالتجميد لتوليد سقالة 3D التي يسهل اختراقها مع الهندسة واضحة المعالم. يمثل مقياس شريط 1 سم. 6B) لتصنيع ناقل دقيق، وelectrosprayed تعليق ECM cryomilled لتوليد ناقل دقيق كروية منفصلة. يمثل مقياس شريط 2 مم. 7. الرغاوي وناقل دقيق ومن ثم يمكن ممهى تدريجيا والمصنف مع الخلايا. وتظهر الصور التمثيلية للمخولا لصيانة طائرات الإنسان (خلايا قابلة للحياة = الأخضر) المصنف على رغوة DAT (يسار) وDAT ناقل دقيق (يمين). تمثل الحانات مقياس 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
Representative Results
Discussion
بشكل عام، يمكن bioscaffolds المستمدة من الأنسجة decellularized تقارب أوثق تكوين معقدة 3D وهيكل ECM في المكروية الخلوية المحلية بالمقارنة مع السقالات الاصطناعية أو نماذج الثقافة القياسية على أساس 2D برامج التعاون الفني. كما نوقش سابقا، التفاعلات خلية ECM هي ذات أهمية حاسمة في التوسط السلوك الخلوية على حد سواء في الثقافة وفي الجسم 1. وإذ تدرك أن الخصائص الكيميائية الحيوية، الفيزيائية الحيوية، والنشاط الحيوي للECM هي فريدة من نوعها في كل الأنسجة، وهناك أدلة متزايدة على أن دعم المنطقي لتطبيق نهج الأنسجة محددة في تصميم المواد الحيوية لهندسة الأنسجة، وكذلك في تطوير أكثر من الناحية الفسيولوجية نماذج الثقافة ذات الصلة ب في التجارب المختبرية 20. استخدام الأنسجة decellularized كمادة أولية، يمكن أن طرقنا تتضمن تركيبة معقدة من ECM الأنسجة محددة ضمن أكثر الزبونصيغ سقالة omizable. في حين أن خطوات المعالجة الميكانيكية والأنزيمية سوف يؤدي إلى فقدان التركيب الدقيق ECM الأصلي، وقد أظهرت دراسات سابقة مع DAT التي يتم حفظها آثار مفيدة للECM الدهنية المشتقة في هذه الأشكال سقالة، مما يشير إلى أن تكوين bioscaffold هو الوسيط الرئيسي وظيفة الخلايا 11، 29. وهناك ميزة كبيرة لاستخدام الرغاوي وناقل دقيق المستمدة ECM بمثابة ركائز ثقافة الخلية بالمقارنة مع الأنسجة decellularized سليمة هي أنها أكثر تجانسا، التي يمكن أن تحسن التوحيد في توزيع الخلايا والتفاعلات خلية خلية / خلية ECM.
الأساليب المذكورة هنا يمكن استخدامها لتوليد مجموعة واسعة من bioscaffolds الأنسجة محددة لاستخدامها في زراعة الخلايا والأنسجة تطبيقات الهندسة. على سبيل المثال، بالإضافة إلى DAT، DDT، وDLV، وقد طبقت مختبرنا بنجاح هذه التقنيات لتوليد 3D بورالرغاوي الأوس باستخدام العظام decellularized والغضاريف والنواة اللبية، والتليف الحلقة، وكذلك المتاحة تجاريا، والكولاجين غير قابلة للذوبان المستمدة من وتر البقري. من وجهة نظر في المختبر، ويمكن استخدام هذه bioscaffolds كأساس لالإخلاص أعلى نماذج الثقافة 3D للتحقيق في الخلوي وعلم الأحياء، علم وظائف الأعضاء أو علم الأمراض 38، بمثابة ركائز النشطة بيولوجيا في الإنتاجية العالية منصات فحص المخدرات 39، أو المصفوفات كما مفيدة لالجذعية التمايز 40 و 41 خلية. DAT، DDT وDLV الرغاوي ملفقة بتركيزات من 25 – 50 ملغ / مل مستقرة في المدى الطويل في الثقافة المختبر (اختبار تصل إلى 28 يوما). وعلاوة على ذلك، يمكن لجميع الأنواع الثلاثة من ناقل دقيق دعم مرفق الخلية وانتشارها في ظل ظروف دينامية في نظام الثقافة الدوار القص منخفضة (10-15 دورة في الدقيقة) لمدة 2 أسابيع على الأقل. لتقديم الطلبات في الجسم الحي، وحيويا وbiodegradaبلي الرغاوي وناقل دقيق المستمدة ECM تبشر كمنتجات قبالة الجاهزة للاستخدام لتحفيز إعادة تشكيل الأنسجة بناء وتجديد 11، 29. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام السقالات خلايا لاصقة كما نظم تسليم العلاج بالخلايا 42 و 43. وكمثال على ذلك، عرضت الرغاوي DAT لتعزيز الأوعية الدموية وتكون الشحم عند المصنف مع مخولا لصيانة طائرات خيفي وزرعها تحت الجلد في نموذج الفئران مناعيا 29. بالنسبة إلى DAT سليمة والمواد الرغوية وDAT معالجة أكثر شدة تتحلل بسرعة أكثر من ذلك بكثير، مع تخفيض 50٪ في حجم لوحظ في 3 أسابيع لأنها أصبحت متكاملة مع الأنسجة المضيف، وشبه كامل ارتشاف بنسبة 12 أسابيع. ومع ذلك، كما يتسبب الرغاوي استجابة عائية أكثر فعالية، مما يدل على أن ECM-هضم انزيم زيارتها آثار فريدة من نوعها المؤيدة للالتجدد. وبالمثل، يمكن استخدام ناقل دقيق المستمدة ECM كما هو الحال في المختبر </ م> ركائز ثقافة الخلية داخل النظم ثقافة ديناميكية وكما حقن المركبات تسليم خلية 11، 30، 44. وبشكل أكثر تحديدا، يمكن أن قطر وسطح كبير مساحة صغيرة من ناقل دقيق تمكين إيصال كمية كبيرة من الخلايا في حجم صغير، مع توفير المصفوفة التي قد تساعد على دعم بقاء الخلية وزيادة الاحتفاظ الخلية في موقع الحقن 30. قبل استخدامها في أي نظام المعيشة، فمن الأهمية بمكان لضمان أن ECM مصدر يخلو كبير من المكونات الخلوية مولدة و / أو الكواشف decellularization يحتمل أن تكون سامة للخلايا التي يمكن أن تثير رد فعل المضيف السلبية 7.
يستخدم البيبسين انزيم بروتين عادة في إعداد الهلاميات المائية المستمدة ECM 15. البيبسين هو الأنزيم البروتيني غير محددة من شأنها أن هضم الكولاجين وغيرها من ECM البروتينات كثافة العملياتس 45 أجزاء صغيرة. في حين تم الإبلاغ عن الهلاميات المائية ملفقة من ECM-هضم الببسين أن يكون لها آثار خلايا مفيدة، والحد هو أن هذه المواد تميل إلى أن تكون غاية ضعيفة ميكانيكيا 46. لدينا في التطوير الأولي للناقل دقيق DAT، نحن تستخدم نهج المركب الذي كان الجمع بين البيبسين هضم DAT مع الجينات، وأضاف قطرة قطرة إلى CaCl 2 لتشكيل حبات كروية (30). كانت حبات في وقت لاحق الصور عبر ربط وتم استخراج الجينات باستخدام سيترات الصوديوم. بالإضافة إلى متطلبات يشابك الكيميائية، وكان قيود مفتاح أن ناقل دقيق ملفقة مع هذا النهج كان الاستقرار الفقراء أقل من حجم مجموعة من 900-950 ميكرون 30. في مكان البيبسين، والأساليب المقدمة هنا الاستفادة من عملية الهضم أكثر معتدل من ECM مع انزيم حال السكر α الأميليز، والذي يفترض أن يلتصق مجموعة الكربوهيدرات من telopeالمناطق ptide الكولاجين، وبالتالي زيادة القابلية للذوبان في حمض الخليك 37. هذا النهج يمكن عزل الكولاجين بلمرة للغاية التي يمكن استخدامها لتوليد الرغاوي وناقل دقيق المستمدة ECM نقية دون الحاجة إلى يشابك الكيميائية أو غيرها من المواد المضافة. واستقرت هذه bioscaffolds من خلال التفاعلات الفيزيائية والرابطة الهيدروجينية بين الألياف الكولاجين المحفوظة جيدا، على غرار الكولاجين في المكروية ECM الأم.
الرغاوي هي منصة مرنة للغاية والتي يمكن أن تكون ملفقة في مجموعة واسعة من هندستها اعتمادا على قالب معين المحدد. لدراسات ثقافة الخلية، يمكن التصويت الرغاوي مباشرة في لوحات جيدا برامج التعاون الفني، لتشكيل الطلاء أو السقالات 3D متفاوتة سمك. لافتعال الرغاوي 3D مع الأسطح موحدة جدا، فمن المستحسن أن قالب مخصص تم تصميمه التي يمكن أن تكون مختومة على كلا الجانبين من البلاستيك أو الزجاج الشرائح. إما ECM مفروم أو cryomilled يمكن استخدامها لتجميعالرغاوي. بشكل عام، وجدنا أن الرغاوي cryomilled تميل إلى أن تكون أكثر ليونة ظاهريا ولها التركيب الدقيق أكثر تعطلت بتركيزات أقل 31 و 36. اعتمادا على مصدر الأنسجة، قد يسبب خطوات المعالجة الميكانيكية إضافية تغييرات في تكوين ECM التي يمكن أن تؤثر وظيفة الخلية. على سبيل المثال، في عملنا السابق، تم الكشف عن laminin في الرغاوي DLV المفروم، ولكن ليس cryomilled DLV الرغاوي 31. في المقابل، تم الكشف عن الكولاجين I، الكولاجين الرابع، laminin وفبرونيكتين في كل المفروم وcryomilled DAT الرغاوي 36. بالإضافة إلى خطوات المعالجة الميكانيكية، وحجم المسامية والمسام من الرغاوي يمكن ضبطها إلى حد ما من خلال تغيير تركيز تعليق ECM ودرجة حرارة التجمد 47. بشكل عام، وانخفاض تركيز المواد الرغوية (~ 10-15 ملغ / مل) هي نوعيا أكثر مسامية، ولكن قد يصاب بسرعة ولها الفقيرةالاستقرار في الثقافة على المدى الطويل 31 و 36. وبالمثل، فإن معدل تجميد أبطأ، حقق عادة من قبل أعلى درجة حرارة التجمد، يمكن أن يؤدي إلى مسام أكبر في الرغاوى نظرا لحجم بلورات الجليد تشكلت خلال تلفيق 29. كل من هذه المعايير قد تؤثر على التفاعلات الخلية التي تحتوي على المواد، بما في ذلك المرفق، تسلل، وإعادة عرض. على سبيل المثال، نمو الخلايا على الرغاوي التي هي ملفقة مع تركيزات أعلى ECM قد تكون محدودة للمناطق السطح، لا سيما مع مصادر ECM المفروم وفي ظل ظروف ثقافة ثابتة 36.
لناقل دقيق، والمعايير الأساسية التي يمكن ضبطها هي تركيز تعليق ECM، إبرة قياس، والجهد التطبيقية، مع تركيزات أعلى عادة يحقق ناقل دقيق التي هي أكثر استقرارا في ظل ثقافة ديناميكية على المدى الطويل. بعد بدء electrospraying، وsuspens ECMيجب قطرات أيون تسقط بسرعة في وسط قارورة، نحو اتجاه جامع رقائق الألومنيوم. لمنع التجميع، فمن المهم أن حبات الاتصال النيتروجين السائل قبل احباط. المسافة بين الإبرة وسطح النيتروجين السائل يمكن تعديلها لتلبية هذه الاحتياجات. ومن المهم أن نلاحظ أن الأمثل قد يكون مطلوبا تبعا لخصائص كل مصدر ECM محددة، ولا سيما في تحديد النطاق تركيز من شأنها أن تولد bioscaffolds مستقرة. عامل رئيسي آخر هو بروتوكول decellularization التي يتم استخدامها لتوليد المواد الأولية، وطرق decellularization التي تحط من ECM أو وجود الكواشف المتبقية (على سبيل المثال، السطحي) قد تؤثر سلبا على استقرار الرغاوي الناتجة وناقل دقيق. إذا واجهت تحديات مع استقرار bioscaffold، والخيارات التي يمكن أن يتم التحقيق تشمل باستخدام عملية الإماهة أكثر تدرجا، وزيادة المعل ECMتركيز ension، واستكشاف مفروم مقابل ECM cryomilled. ينبغي لجميع هذه الخيارات تفشل في حل المشكلة، قد يكون من الضروري لاستكشاف بروتوكولات decellularization أو مصادر ECM بديل.
لضمان استنساخ أثناء الإنتاج سقالة، يجب توخي الحذر خاصة في خطوات معينة في البروتوكول. عندما cryomilling الأنسجة decellularized، فمن المستحسن أن طحن أن تتم مباشرة بعد بالتجفيد في بيئة جافة للحد من احتمال تجميع الجسيمات نظرا لامتصاص الرطوبة من البيئة. خلال تلفيق ناقل دقيق، يقترح أن تعليق وelectrosprayed في دفعات صغيرة، مع حجم الحد الأقصى من 3 مل، لتجنب المشاكل مع عينة التبريد التي يمكن أن تؤدي إلى انسداد الإبرة. وعلاوة على ذلك، فمن الضروري أن ناقل دقيق لا يسمح لذوبان الجليد بعد عملية electrospraying. للحفاظ على الهندسة الكروية والاستقرار الميكانيكي، وmicrocarriالمتطلبات البيئية ينبغي جمع من النيتروجين السائل، وتنقل في حاوية مملوءة النيتروجين السائل، ومجفف بالتجميد على الفور. وأخيرا، بالنسبة لكل من الرغاوي وناقل دقيق، فمن الأهمية بمكان أن الخطوات الإماهة تتم ببطء على مدى فترة من عدة أيام. الإماهة السريع يمكن أن يؤدي إلى انهيار الهيكلي على المستويين الكلي و / أو الصغيرة الحجم. وعلاوة على ذلك، يجب أن يحدث الإماهة ببطء لمنع تشكيل فقاعات الهواء الصغيرة داخل سقالة، التي يمكن أن تتطلب قدرا كبيرا من الوقت لديغا في ظل فراغ خفيفة.
وفي الختام، والأساليب المقدمة في هذه الورقة يمكن استخدامها لتصنيع مجموعة متنوعة من المواد الرغوية الأنسجة محددة وناقل دقيق يتكون من الذهب الخالص، ECM غير كيميائيا عبر ربط. ميزة للباحثين البيولوجي هي أن bioscaffolds من السهل التعامل معها ويمكن معالجتها على نحو مماثل لالأنسجة عند إجراء التحليلات مع تقنيات مثل الأنسجة، المناعية، أو الجينات والبروتينات المقايسات.وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للالسقالات المستمدة ECM يكون تدهور إنزيمي لاستخراج السكان الخلية المصنف أو يمكن استخدامها مباشرة بوصفها وسائل إيصال الخلايا القابلة للتحلل وحيويا. عموما، هذه التكنولوجيا منصة مرنة يحمل فائدة كبيرة للعديد من التطبيقات بما في ذلك دراسات ثقافة الخلية 3D التحقيق وظيفة الخلية، بمثابة ركائز توسيع الخلية، وbioscaffolds موالية للالتجديدي.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada and the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) have provided funding for this work. The authors would like to acknowledge Dr. Amin Rizkalla for the use of his electrospraying system, the Nanofabrication Facility at Western University for use of SEM imaging equipment, the Mount Brydges Abattoir for the provision of porcine tissue samples, and Drs. Aaron Grant, Brian Evans, and Robert Richards for their clinical collaborations in support of this research.
Materials
| Acetic acid, glacial | BioShop | ACE222.500 | |
| Alligator clip leads | VWR | 470149-728 | |
| Aluminium foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
| a-amylase | Sigma | 101074694 | from Aspergillus aryzae |
| Analytical balance | Sartorius | CPA225D | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004251 | With swinging bucket rotor for 15 and 50 mL centrifuge tubes |
| Centrifuge tubes (15 mL) | Sarstedt | 62.554.205 | |
| Centrifuge tubes (50 mL) | Sarstedt | 62.547.205 | |
| Collagen from bovine achilles tendon (insoluble) | Sigma | C9879 | Or similar insoluble collagen source; Can be used as an alternative to decellularized tissues to fabricate the foams and microcarriers |
| Cryomilling system | Retsch | 20.745.0001 | MM 400 |
| Dessicator | Fisher Scientific | 8624426 | For lyophilized ECM and bioscaffold storage |
| DMEM: F12 Hams | Sigma | D6421 | Used for proliferation media |
| Dewar flask | Fisher Scientific | 10-196-6 | Low form; volume range of 250 – 500 mL |
| Double distilled water | From Barnstead GenPure xCAD Water Purification System | ||
| D-PBS | Wisent | 311425125 | |
| ECM | Isolated from human adipose tissue, porcine dermis or porcine myocardium, as described in Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010, and Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32) | ||
| Ethanol | Greenfield Specialty Alcohols Inc. | P016EAAN | Absolute |
| Fetal bovine serum | Wisent | 80150 | Used for proliferation media |
| Forceps | VWR | 37-501-32 | For transferring the foams |
| Freezer (-20 °C) | VWR | 97043-346 | |
| Freezer ( -80 °C) | Thermo Scientific | EXF40086A | |
| Glass vials | Fisher Scientific | 03-339-26D | To store lyophilized cryomilled ECM |
| Hand held homogenizer | Fisher Scientific | 14-359-251 | Speed: 8000 – 30,000 RPM |
| Homogenizer accessories: saw tooth bottom generator probes | Fisher Scientific | 14-261-17 | 10 X 95 mm |
| Liquid nitrogen | For electrospraying | ||
| Lyophilizer | Labconco | 7750021 | FreeZone4.5 |
| Milling chamber | Retsch | 02.462.0213 | 25 mL volume recommended |
| Milling balls | VWR | 16003-606 | 10 mm diameter, stainless steel recommended |
| 18G needle | VWR | C ABD305185 | For dispensing ECM suspension into moulds |
| Orbital incubator shaker | SciLogex | 832010089999 | Temperature controlled (37 °C) |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | Used for proliferation media |
| Pipet-Aid XP | Mandel Scientific | DRU-4-000-101 | |
| Retort stand | VWR | 470019-526 | |
| Retort stand clamp | VWR | 21573-606 | |
| Safety-Lok Syringe | BD | 309606 | 3 mL luer lock syringe for microcarrier fabrication and dispensing ECM suspension |
| Serological pipettes (10 mL ) | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Serological pipettes (25 mL) | Sarstedt | 86.1685.001 | |
| Sodium chloride | BioShop | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic | BioShop | 10049-21-5 | |
| Scoopula | VWR | 89259-968 | For collecting microcarriers |
| Surgical scissors | VWR | 82027-590 | |
| Syringe pump | VWR | 10117-490 | Microprocessor controlled |
| High voltage power supply | Gamma High Voltage Research | ES30P-5W/DDPM | Capable of recommended 15 – 25 kV voltage range |
| 12-well plates | Fisher Scientific | 12565321 | For use as molds during foam fabrication; Other sizes or user-defined molds can also be selected |
| Winged infusion set | Terumo | 22258092 | 30 cm tubing length, 25 G 3/4 " recommended; Other needle gauges can be used and may influence microcarrier diameter |
References
- Eweida, A. M., Marei, M. K. Naturally Occurring Extracellular Matrix Scaffolds for Dermal Regeneration: Do They Really Need Cells?. Biomed Res Int. , 1-9 (2015).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
- Rosso, F., Giordano, A., Barbarisi, M., Barbarisi, A. From Cell-ECM Interactions to Tissue Engineering. J. Cell. Phys. 199 (2), 174-180 (2004).
- Du, J., et al. Extracellular Matrix Stiffness Dictates Wnt Expression Through Integrin Pathway. Sci. Rep. 6, 4195-4200 (2016).
- Badylak, S. F. The Extracellular Matrix as a Scaffold for Tissue Reconstruction. Cell & Dev. Biol. 13 (2), 377-383 (2002).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of Tissues and Organs. Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An Overview of Tissue and Whole Organ Decellularization Processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Reing, J. E., et al. The Effects of Processing Methods Upon Mechanical and Biologic Properties of Porcine Dermal Extracellular Matrix Scaffolds. Biomaterials. 31 (33), 8626-8633 (2010).
- Yang, Q., et al. Morphological Appearance, Content of Extracellular Matrix and Vascular Density of Lung Metastases Predicts Permissiveness to Infiltration by Adoptively Transferred Natural Killer and T Cells. Cancer Immun. Immunother. 55 (6), 699-707 (2006).
- Calle, E., Ghaedi, M., Sundaram, S., Sivarapatna, A., Tseng, M. K., Niklason, L. E. Strategies for Whole Lung Tissue Engineering. IEEE Trans. Biomed. Eng. 61 (5), 1482-1496 (2014).
- Turner, A. E. B., Yu, C., Bianco, J., Watkins, J. F., Flynn, L. E. The Performance of Decellularized Adipose Tissue Microcarriers as an Inductive Substrate for Human Adipose-Derived Stem Cells. Biomaterials. 33 (18), 4490-4499 (2012).
- Brown, C. F. C., Yan, J., Han, T. T. Y., Marecak, D. M., Amsden, B. G., Flynn, L. E. Effect of Decellularized Adipose Tissue Particle Size and Cell Density on Adipose-Derived Stem Cell Proliferation and Adipogenic Differentiation in Composite Methacrylated Chondroitin Sulphate. Biomed. Mater. 10 (4), 1-12 (2015).
- Cheung, H. K., Han, T. T. Y., Marecak, D. M., Watkins, J. F., Amsden, B. G., Flynn, L. E. Composite Hydrogel Scaffolds Incorporating Decellularized Adipose Tissue for Soft Tissue Engineering with Adipose-Derived Stem Cells. Biomaterials. 35 (6), 1914-1923 (2014).
- Almeida, H. V., Eswaramoorthy, R., Cunniffe, G. M., Buckley, C. T., O’Brien, F. J., Kelly, D. J. Fibrin Hydrogels Functionalized with Cartilage Extracellular Matrix and Incorporating Freshly Isolated Stromal Cells as an Injectable for Cartilage Regeneration. Acta Biomat. 36, 55-62 (2016).
- Wassenaar, J. W., Braden, R. L., Osborn, K. G., Christman, K. L. Modulating in vivo Degradation Rate of Injectable Extracellular Matrix Hydrogels. J. Mater. Chem. B. 4 (16), 2794-2802 (2016).
- Ugerleider, J. L., et al. Extracellular Matrix Hydrogel Promotes Tissue Remodeling, Arteriogenesis, and Perfusion in a Rat Hindlimb Ischemia Model. JACC Basic Transl. Sci. 1 (1-2), 32-44 (2015).
- Nagao, R. J., et al. Decellularized Human Kidney Cortex Hydrogels Enhance Kidney Microvascular Endothelial Cell Maturation and Quiescence. Tissue Eng. Part A. 22 (19-20), 1140-1150 (2016).
- Pati, F., et al. Printing Three-Dimensional Tissue Analogues with Decellularized Extracellular. Matrix Bioink. Nat. Commun. 5, 3935 (2014).
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. 3D Cell Culture Systems – Advantages and Applications. J. Cell. Phys. 230 (1), 16-26 (2015).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. Three-dimensional Cell Culture Matrices: State of the Art. Tissue Eng Part B, Rev. 14 (1), 61-86 (2008).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The Third Dimension Bridges the Gap Between Cell Culture and Live Tissue. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
- Bouet, G., Marchat, D., Cruel, M., Malaval, L., Vico, L. In Vitro Three-Dimensional Bone Tissue Models: From Cells to Controlled and Dynamic Environment. Tissue Eng. Part B Rev. 21 (1), 133-156 (2015).
- Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. Gene Expression Perturbation in vitro – A Growing Case for Three-Dimensional (3D) Culture Systems. Sem. Cancer Biol. 15 (5), 405-412 (2005).
- Bonnier, F., et al. Cell Viability Assessment Using the Alamar Blue Assay: A Comparison of 2D and 3D Cell Culture Models. Toxicology in vitro. 29 (1), 124-131 (2015).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The Extracellular Matrix at a Glance. J. Cell Sci. 123, 4195-4200 (2010).
- Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. Differential Effects of Tissue Culture Coating Substrates on Prostate Cancer Cell Adherence, Morphology and Behavior. PLoS ONE. 9 (11), e112122 (2014).
- McKee, C., Perez-Cruet, M., Chavez, F., Chaudhry, G. R. Simplified Three-Dimensional Culture System for Long-Term Expansion of Embryonic Stem Cells. World J. Stem Cells. 7 (7), 1064-1077 (2015).
- Flynn, L. E. The Use of Decellularized Adipose Tissue to Provide an Inductive Microenvironment for the Adipogenic Differentiation of Human Adipose-Derived Stem Cells. Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).
- Yu, C., et al. Porous Decellularized Adipose Tissue Foams for Soft Tissue Regeneration. Biomaterials. 34 (13), 3290-3302 (2013).
- Turner, A. E. B., Flynn, L. E. Design and Characterization of Tissue-Specific Extracellular Matrix-Derived Microcarriers. Tissue Eng. Part C: Methods. 18 (3), 186-197 (2012).
- Russo, V., Omidi, E., Samani, A., Hamilton, A., Flynn, L. E. Porous, Ventricular Extracellular Matrix-Derived Foams as a Platform for Cardiac Cell Culture. Biores Open Access. 4 (1), 374-388 (2015).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of Cardiac Extracellular Matrix from an Intact Porcine Heart. Tissue Eng. Part C, Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
- Owen, S. C., Fisher, S. A., Tam, R. Y., Nimmo, C. M., Shoichet, M. S. Hyaluronic Acid Click Hydrogels Emulate the Extracellular Matrix. Langmuir. 29 (24), 7393-7400 (2013).
- Zargham, S., Bazgir, S., Tavakoli, A., Rashidi, A. S., Damerchely, R. The Effect of Flow Rate on Morphology and Deposition Area of Electrospun Nylon 6 Nanofiber. J. Eng. Fibers Fabr. 7 (4), 42-49 (2012).
- Gryshkov, O., Pogozhykh, D., Zernetsch, H., Hofmann, N., Mueller, T., Glasmacher, B. Process Engineering of High Voltage Alginate Encapsulation of Mesenchymal Stem Cells. Mater. Sci. Eng. C Biol. Appl. 36, 77-83 (2014).
- Turco, B. . Characterization and Cell-Seeding of Decellularized Adipose Tissue Foams for Wound Healing. , (2014).
- Steven, F. S. The Nishihara Technique for the Solubilization of Collagen. Application To the Preparation of Soluble Collagens From Normal and Rheumatoid Connective Tissue. Ann. Rheum. Dis. 23, 300-301 (1964).
- Hansen, N. U. B., Genovese, F., Leeming, D. J., Karsdal, M. A. The Importance of Extracellular Matrix for Cell Function and in vivo Likeness. Exp. Mol. Pathol. 98 (2), 286-294 (2015).
- Justice, B. A., Badr, N. A., Felder, R. A. 3D Cell Culture Opens New Dimensions in Cell-Based Assays. Drug Discov. Today. 14 (1-2), 102-107 (2009).
- Cortiella, J., et al. Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation. Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2565-2580 (2010).
- Liao, J., Guo, X., Grande-Allen, K. J., Kasper, F. K., Mikos, A. G. Bioactive Polymer/Extracellular Matrix Scaffolds Fabricated with a Flow Perfusion Bioreactor for Cartilage Tissue Engineering. Biomaterials. 31 (34), 8911-8920 (2010).
- Choi, Y. C., Choi, J. S., Woo, C. H., Cho, Y. W. Stem Cell Delivery Systems Inspired by Tissue-Specific Niches. J. Control. Release. 193, 42-50 (2014).
- Han, T. T. Y., Toutounji, S., Amsden, B. G., Flynn, L. E. Adipose-Derived Stromal Cells Mediate in vivo Adipogenesis , Angiogenesis and Inflammation in Decellularized Adipose Tissue Bioscaffolds. Biomaterials. 72, 125-137 (2015).
- Yu, C., Kornmuller, A., Flynn, L. E. Porous Decellularized Extracellular Matrix Microcarriers for Tissue-Specific Cell Expansion and Delivery. Front. Bioeng. Biotechnol. , (2016).
- Qian, J., et al. Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin. J. Food Sci. 81 (1), C27-C34 (2016).
- Lin, H., Yang, G., Tan, J., Tuan, R. S. Influence of Decellularized Matrix Derived from Human Mesenchymal Stem Cells on their Proliferation, Migration and Multi-Lineage Differentiation Potential. Biomaterials. 33 (18), 4480-4489 (2012).
- Fonte, P., Reis, S., Sarmento, B. Facts and Evidences on the Lyophilization of Polymeric Nanoparticles for Drug Delivery. J. Control. Release. 225, 75-86 (2016).
