Ein Protokoll zur Charakterisierung der morphologischen Veränderungen von<em> Clostridium difficile</em> In Antwort auf Antibiotika-Behandlung
Summary
Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.
Abstract
Die Beurteilung von Antibiotika-Maßnahmen mit neuer Arzneimittelentwicklung, die auf anaerobe Bakterien gerichtet ist, ist schwierig und technisch anspruchsvoll. Um einen Einblick in mögliche MOA zu erhalten, können morphologische Veränderungen, die mit der Antibiotika-Exposition verbunden sind, mittels Rasterelektronenmikroskopie (SEM) sichtbar gemacht werden. Die Integration von SEM-Imaging mit traditionellen Kill-Kurven kann unsere Einsicht in die Drogen-Aktion verbessern und den Drogenentwicklungsprozess vorantreiben. Um diese Prämisse zu testen, wurden Killkurven und SEM-Studien unter Verwendung von Arzneimitteln mit bekannten, aber unterschiedlichen MOA (Vancomycin und Metronidazol) durchgeführt. C. difficile Zellen (R20291) wurden mit oder ohne Anwesenheit von Antibiotika bis zu 48 h gezüchtet. Während des 48-Stunden-Intervalls wurden die Zellen zu mehreren Zeitpunkten gesammelt, um die antibiotische Wirksamkeit und die Bildgebung auf dem SEM zu bestimmen. In Übereinstimmung mit früheren Berichten hatten Vancomycin und Metronidazol eine signifikante bakterizide Aktivität nach 24 h Behandlung, gemessen durch eine koloniebildende Einheit (CFU)Ting Mit SEM-Bildgebung haben wir festgestellt, dass Metronidazol signifikante Auswirkungen auf die Zelllänge hatte (> 50% Reduktion der Zelllänge für jedes Antibiotikum, P <0,05) im Vergleich zu Kontrollen und Vancomycin. Während die phänotypische Reaktion auf die medikamentöse Behandlung bisher nicht auf diese Weise dokumentiert wurde, stimmen sie mit dem MOA des Arzneimittels überein, das die Vielseitigkeit und Zuverlässigkeit der Bildgebung und Messungen und die Anwendung dieser Technik für andere experimentelle Verbindungen zeigt.
Introduction
Clostridium difficile ist ein gram-positives, sporenbildendes Bakterium, das jährlich etwa 500.000 Infektionen in den USA verursacht und als Bedrohungsstufe für die Disease Control and Prevention (CDC), das höchste Risiko, als Bedrohungsniveau angesehen wird. 1 Das vergangene Jahrzehnt hat eine beträchtliche Arzneimittelentwicklung in antimikrobiellen Mitteln mit Aktivität gegen C. difficile beobachtet . 2 , 3 In-vitro- Studien sind ein notwendiger Bestandteil des Arzneimittelentwicklungsprozesses. 4 Herkömmlicherweise werden in vitro- Anfälligkeit und Zeit – Tötungsstudien verwendet, um zukünftige Tier- und andere in vivo- Studien zu validieren.
Während diese Methoden eine wichtige Rolle bei der Bewertung von Tötungsaktionen spielen, erfassen sie nicht die phänotypische Reaktion der Zellen auf die pharmakologische Behandlung. Durch die Einbeziehung der Rasterelektronenmikroskopie (SEM) mit StandarD töten kinetische Studien, eine gründlichere Charakterisierung der antibiotischen direkten Effekte ist möglich. 5 , 6 , 7 Hier stellen wir ein Verfahren vor, bei dem SEM als Mittel zur Profilierung der Wirksamkeit der Antibiotika-Behandlung verwendet wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Ziel der vorliegenden Studie war es, eine Hochdurchsatzmethode zur Isolierung von C. difficile und zur Untersuchung von Antibiotika-Suszeptibilität mittels Rasterelektronenmikroskopie (SEM) als Mittel zur gründlicheren Charakterisierung der pharmakologischen Wirkung des Antibiotikums zu schaffen. Mit den hier skizzierten Protokollen haben wir gezeigt, dass die bildgebung der phänotypischen Antwort der Zelle auf die antibiotische Behandlung einen Einblick in die pharmakologische Wirkung des Arzneimittels …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
These experiments have been supported by research grants from Merck and Co. and Summit, PLC.
Materials
| cotton gauze | Caring | PRM21408C | |
| NaCl | Macron | 7532 | |
| 50mL tubes | Falcon | 352098 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Criterion | C5141 | |
| L-cysteine | Alfa Aesar | A10389 | |
| yeast extract | Criterion | C741 | |
| sodium taurocholate | Alfa Aesar | A18346 | |
| anaerobic chamber | Coy | vinyl anaerobic chamber | |
| cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates | Anaerobe systems | AS-213 | |
| blood agar plates | Hardy diagnostics | A-10 | |
| latex agglutination reagent | Oxoid | DR1107A | C. diff test kit |
| microcentrifuge tubes | Eppendorf | 222363204 | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | 50-259-98 | |
| microscope slides | J. Melvin freed brand | 7525M | 75x25mm |
| flow hood | Labconco | Class II type A2 | biosafety cabinet |
| desk sputtering machine | Denton Vacuum | Desk II | |
| tape | Plastic Core | 05072-AB | SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape |
| gold | Denton Vacuum | TAR001-0158 | 2.375” Diameter x .002” Thick Gold foil |
| scanning electron microscope | FEI | XL-30 |
References
- Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile infection in the United States. N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).
- Vickers, R. J., et al. Ridinilazole: a novel therapy for Clostridium difficile infection. Int J Antimicrob Agents. 48 (2), 137-143 (2016).
- Shah, D., et al. Clostridium difficile infection: update on emerging antibiotic treatment options and antibiotic resistance. Expert Rev Anti Infect Ther. 8 (5), 555-564 (2010).
- Ambrose, P. G., et al. New EMA guideline for antimicrobial development. Lancet Infect Dis. 12 (4), 265-266 (2012).
- Bassères, E., et al. Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection. J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).
- Endres, B. T., et al. A novel method for imaging the pharmacological effects of antibiotic treatment on Clostridium difficile. Anaerobe. 40, 10-14 (2016).
- Endres, B. T., et al. Evaluating the Effects of Surotomycin Treatment on Clostridium difficile Toxin A and B Production, Immune Response, and Morphological Changes. Antimicrob Agents Chemother. 60 (6), 3519-3523 (2016).
- Alam, M. J., Anu, A., Walk, S. T., Garey, K. W. Investigation of potentially pathogenic Clostridium difficile contamination in household environs. Anaerobe. 27, 31-33 (2014).
- Aitken, S. L., et al. In the Endemic Setting, Clostridium difficile Ribotype 027 Is Virulent But Not Hypervirulent. Infect Control Hosp Epidemiol. , 1-6 (2015).
- Basseres, E., et al. Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection. J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).
- Walters, B. A., Roberts, R., Stafford, R., Seneviratne, E. Relapse of antibiotic associated colitis: endogenous persistence of Clostridium difficile during vancomycin therapy. Gut. 24 (3), 206-212 (1983).
- Chilton, C. H., et al. Evaluation of the effect of oritavancin on Clostridium difficile spore germination, outgrowth and recovery. J Antimicrob Chemother. 68 (9), 2078-2082 (2013).
- Ofosu, A. Clostridium difficile infection: a review of current and emerging therapies. Ann Gastroenterol. 29 (2), 147-154 (2016).
- McDonald, L. C., et al. An epidemic, toxin gene-variant strain of Clostridium difficile. New Eng J Med. 353 (23), 2433-2441 (2005).
