Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화 연구 Neuroprotection 및 종양 세포의 침입을 모델로
Summary
Organotypic hippocampal 슬라이스 문화 (OHSC) 아주 잘 vivo에서 상황을 시뮬레이션 하는 체 외에서 모델을 나타냅니다. 여기 설명 vibratome 기반 소설 물질의 신경 가능성 또는 종양 세포의 생물학 행동 평가에 사용 하기 위해 고품질 슬라이스를 얻기 위해 프로토콜을 깔 끔 히 개선 합니다.
Abstract
Organotypic hippocampal 슬라이스 문화 (OHSC), 신경 그리고 glial 세포의 형태학 적 및 기능적 특성은 잘 보존 된. 이 모델은 neuroprotection, 뉴런, 신경 네트워크 또는 종양 침입에 electrophysiological 실험 연구를 포함 하는 다양 한 연구 질문을 해결 하는 데 적합 합니다. Hippocampal 건축과 multisynaptic 회로에 신경 활동은 잘 보존 OHSC, 비록 조각화 절차 자체가 처음 병 변 및 glial 흉터의 형성에 이르게. 흉터 형성 아마도 기계적 특성 및 작은 분자, 등의 방산 동작을 변경합니다. 분할 영역 동물 수술, 그리고 다양 한 두뇌 파생 된 셀 형식, 즉 이다, microglia 및 생리 적 및 병 적인 모두에서 뉴런 간의 상호 작용에 대 한 연구 없이 뇌 손상 후 시간 종속 프로세스의 모니터링 허용 조건입니다. 이 모델의 상반 된 측면 혈 및 면역 혈의 부재 이다. 신경 손상의 진행 하는 동안 혈액 재생 중요 한 역할에서에서 면역 세포를 마이그레이션. 그 셀은 조각에, 문화에 본질적인 프로세스 외부 간섭 없이 관찰 될 수 있습니다. 또한, OHSC에서 중간 외부 환경의 구성 정확 하 게 제어 됩니다. 이 방법의 더 이점은 표준 준비에 비해 희생된 동물의 낮은 수입니다. 몇몇 OHSC는 가능한 한 동물에서 여러 치료와 동시 연구를 만드는 하나의 동물에서 얻을 수 있습니다. 이러한 이유로, OHSC는 조직 손상 후 또는 종양 침공 기간 동안 새로운 보호 치료제의 효과 분석 하는 데 적합.
제시 하는 프로토콜 여기 매우 재현할 수 생성을 허용 하는 OHSC의 준비 방법에 설명 합니다, 그리고 잘 neuroprotection 또는 종양 침입 연구 처럼 실험적인 연구의 다양 한 사용할 수 있는 분할 영역을 보존.
Introduction
OHSC는 공부 microglia1, 이다 및 신경 세포의 생리 및 병 적인 속성을 잘 특징이 생체 외에서 모델입니다. Extracellular 환경을 제어 하 고 다양 한 자극 후 셀룰러 및 형태학 상 변화를 모니터링 하는 것이 쉽습니다. Hippocampal 신경의 조직 및 그들의 연결 준비2,3후 잘 보존 되어 있습니다. 여러 장점 중 OHSC 동물 수술 없이 뇌 상해와 종양 내 습의 모니터링 하실 수 있습니다. 6 ~ 8 OHSC 단일 설치류 두뇌에서 얻어질 수 있다. 크게 동물의 수를 줄이고 같은 동물에 여러 약물 농도, 유전자 조작 또는 다른 병 변 모델을 테스트 허용 OHSC 따라서 도움이 될. 분할 영역 기반 분석 실험에서 실험 조건 정확 하 게 제어할 수 있습니다. 또한, 보조 손해 같은 병 적인 상태의 시간 종속 개발 시간 경과 영상에 의해 쉽게 모니터링할 수 있습니다.
Stoppini 그 외 여러분 에 의해 원래 설립 주어진된 프로토콜에서 4, 준비 단계는 설명 하 고 적절 한 조각의 선택에 대 한 중요 한 형태학 랜드마크 강조 표시 됩니다. 생 후 7-9 일 쥐 또는 산 후 4-5 일 쥐의 준비를 좋습니다. 이 기간에서 OHSC 기계적 충격 및 신경 회로의 개편을 위한 높은 잠재력에 강력한 저항을 표시. 반면, 배아 또는 성인 쥐에서 준비 급속 하 게 그들의 구조를 변경 재배 하는 동안 그들의 organotypic 형태를 잃고 고 따라서 덜 공부 하는 기초 연구5,6 장기 프로세스에 적합 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. OHSC의 생존 율에 대 한 또 다른 중요 한 포인트 확산 및 따라서 영양소 공급은 제한 된12,,1314조각 자체의 두께입니다.
Protocol
에 의해 유럽 공동체 위원회 지침 2010/63/EU 유럽 의회의 승인으로 동물 실험 윤리 정책 및 신경 과학 연구에 있는 동물의 사용에 정책에 따라 수행 했다 고 과학적 목적을 위해 사용 하는 동물의 보호에 유럽 연합의 위원회. 1. 준비의 악기와 문화 미디어 OHSC의 준비에 대 한 사용의 다음 세트: 2 개의 작은 위, 두 곡선된 핀셋, 좋은 팁, 한 트위터 (크기 11, 하나 크기 15의 2)…
Representative Results
Neuroprotection 연구: 신경 손상, PI 긍정적인 핵과 IB4 가 이랑 (DG)의 립 세포 층 (GCL)의 모든 3 광학 섹션에서 microglia 계산 했다 긍정적인의 수를 결정 합니다. 종양 내 습 실험, 스택의 최대 강도 z 프로젝션 계산 침략의 다른 침입 패턴 (그림 6)를 시각화 하는 측정으로 종양 세포에 의해 커버 된 지역에 대 한 사용 되었습니다. <p clas…
Discussion
현재 프로토콜 OHSC의 준비를 설명합니다. 이 모델은 내장 기능 및 뇌 조직의 반응의 생리 및 병리학 자극의 적용 후 테스트 수 있습니다. Electrophysiological 매개 변수 분석, 외 OHSC lesioned 수와 모든 세포 유형에 손상의 효과 확인할 수 있습니다. 다른 물질 및 lesioning 프로세스 또는 대 식 세포와 림프 톨의 부재에서 치유의 자세한 설명과 함께 치료 가능 하다.
The most 중요 한 단계?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 크리스틴 Auste 그의 우수한 기술 지원에 대 한 비디오 녹화 및 종합 Ghadban 그녀의 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다. Urszula Grabiec 루 프로그램 FKZ 29/18에 의해 지원 되었다.
Materials
| 6-Well | Falcon | 35-3046 | |
| Agar | Fluka | 5040 | |
| Autoclav | Systec | DX-45 | |
| CFDA | Thermo Fisher | V12883 | |
| Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700 | Carl Zeiss | ||
| Eagle´s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 32360-034 | |
| Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Labs | FL-1101 | |
| Fluorescein labeled GSL I – isolectin B4 | Vector Labs | FL-1201 | |
| Glucose | Merk | 1083371000 | |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 24020-133 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 14170-138 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I5500 | |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | |
| L-Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| LN229 | Cell-Lines-Service | 300363 | |
| Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue) | B.Braun | 1050052 | |
| Millicell Culture Inserts | Millipore | PICMORG50 | |
| NMDA N-methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Normal Horse Seum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Petri dishes (all sizes) | Greiner | 627160/664160/628160 | |
| PFA | Roth | 0335.1 | toxic |
| Propidium iodid (PI) | Sigma Aldrich | 81845-25MG | toxic |
| U138 | ATCC | HTB-14 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT 1200 |
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Citer Cet Article
Grabiec, U., Hohmann, T., Hammer, N., Dehghani, F. Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells. J. Vis. Exp. (126), e55359, doi:10.3791/55359 (2017).