Organotypischen Hippocampal Slice Kulturen als Modell zur Studie Neuroprotektion und Invasivität der Tumorzellen
Summary
Organotypischen hippocampal Slice Kulturen (OHSC) sind eine in-vitro- Modell, die die in-Vivo -Situation sehr gut simuliert. Hier beschreiben wir eine Vibratome-basierte verbessert schneiden-Protokoll, um qualitativ hochwertige Scheiben für den Einsatz bei der Beurteilung der neuroprotektive Potenzial der neuartigen Substanzen oder das biologische Verhalten der Tumorzellen zu erhalten.
Abstract
Im organotypischen hippocampal Slice Kulturen (OHSC) sind die morphologischen und funktionellen Eigenschaften der Neuronen und Gliazellen gut erhalten. Dieses Modell eignet sich für den Umgang mit verschiedenen Forschungsfragen, die Studien zur Neuroprotektion, Elektrophysiologische Experimente auf Neuronen, neuronale Netze oder Tumorinvasion beinhalten. Der Hippokampus Architektur und neuronaler Aktivität in multisynaptic Schaltungen sind gut konserviert in OHSC, obwohl das slicing Verfahren selbst zunächst Läsionen und führt zur Bildung einer glial Narbe. Die Narbenbildung ändert vermutlich die mechanischen Eigenschaften und diffusiven Verhalten von kleinen Molekülen, etc.. Scheiben erlauben die Überwachung der Zeit abhängigen Prozesse nach Hirnverletzung ohne tierische Chirurgie und Studien zu Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Gehirn abgeleitet Zelltypen, nämlich Astrozyten, Mikroglia und Neuronen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Ein ambivalenter Aspekt dieses Modells ist das Fehlen von Blutfluss und Immunzellen im Blut. Während der Progression der neuronalen Verletzung Migration Immunzellen aus Blut spielen eine wichtige Rolle. Da diese Zellen in Scheiben fehlen, können die innere Prozesse in der Kultur ohne Einmischung von außen beobachtet werden. Darüber hinaus ist die Zusammensetzung der Medium-externe Umwelt in OHSC exakt gesteuert. Ein weiterer Vorteil dieser Methode ist die geringere Anzahl der geopferten Tiere im Vergleich zu standard-Vorbereitungen. Mehreren OHSC erhalten Sie von einem Tier ermöglichen die gleichzeitige Studien mit mehreren Behandlungen in einem Tier. Aus diesen Gründen OHSC sind gut geeignet, um die Auswirkungen der neuen schützenden Therapeutika nach Gewebeschädigung oder während Tumorinvasion analysieren.
Das Protokoll präsentiert hier beschreibt eine Vorbereitung Methode der OHSC, die Erzeugung von hoch reproduzierbare ermöglicht, gut erhaltene Scheiben, die für eine Vielzahl von experimentellen Untersuchungen, wie z.B. Neuroprotektion oder Tumor Invasion Studien verwendet werden können.
Introduction
OHSC sind eine gut charakterisierte in Vitro Modell zur physiologische und pathologische Eigenschaften der Neuronen, Astrozyten und Mikroglia1. Es ist einfach die extrazelluläre Umwelt steuert und überwacht die zellulären und morphologische Veränderungen nach verschiedene Reize. Die Organisation der hippocampal Neuronen und ihre Verbindungen sind nach Vorbereitung2,3gut erhalten. Aus mehrere Vorteile OHSC ermöglichen eine Überwachung der Gehirn Verletzungen und Tumor Invasion ohne tierische Operation. Sechs bis acht OHSC erhalten Sie bei einem einzigen Nagetier Gehirn. OHSC daher deutlich reduzieren die Anzahl der Tiere und ermöglichen testen mehrere Drogen Konzentrationen, genetische Manipulationen oder verschiedene Läsion Modelle im gleichen Tier helfen. Im Slice-based Assays können experimentelle Bedingungen exakt gesteuert werden. Darüber hinaus Zeit abhängige Entwicklung von pathologischen Zuständen wie Folgeschäden durch Time-Lapse-Bildgebung leicht überwacht werden können.
In das angegebene Protokoll, ursprünglich festgelegten Stoppini Et al. 4, die Vorbereitungsschritte sind beschrieben und wichtige morphologische Wahrzeichen für die Auswahl der entsprechenden Scheiben werden hervorgehoben. Es wird empfohlen, die Vorbereitung der postnatalen Tag 7-9 Ratten oder postnatale Tag 4-5 Mäuse. In diesen Perioden OHSC zeigen eine robuste Beständigkeit gegen mechanische Verletzungen und ein hohes Potential für die Reorganisation von neuronalen Schaltkreisen. Im Gegensatz dazu Zubereitungen aus embryonalen oder erwachsenen Ratten schnell ändern ihre Struktur verlieren ihre organotypischen Morphologie während des Anbaus und eignen sich daher weniger für das Studium langfristige Prozesse in Grundlagenforschung5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. ein weiterer kritischer Punkt für die Überlebensrate der OHSC ist die Dicke der Scheibe selbst, da die Diffusion und damit Nährstoffversorgung begrenzte12,13,14 sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung der OHSC. Dieses Modell ermöglicht die Prüfung der inneren Fähigkeiten und Reaktionen von Hirngewebe nach der Anwendung der physiologischen und pathologischen Reize. Neben Analysen elektrophysiologische Parameter kann OHSC lesioned und die Auswirkungen eines Schadens auf alle Zelltypen ermittelt werden. Behandlung mit verschiedenen Substanzen und die detaillierte Beschreibung der schädigendes Prozesse oder in Ermangelung von Makrophagen und Lymphozyten Heilung ist möglich…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Christine Auste für ihre Unterstützung mit der video-Aufzeichnung und Chalid Ghadban für seine hervorragenden technischen Betreuung danken. Urszula Grabiec stützten die Roux Programm FKZ 29/18.
Materials
| 6-Well | Falcon | 35-3046 | |
| Agar | Fluka | 5040 | |
| Autoclav | Systec | DX-45 | |
| CFDA | Thermo Fisher | V12883 | |
| Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700 | Carl Zeiss | ||
| Eagle´s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 32360-034 | |
| Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Labs | FL-1101 | |
| Fluorescein labeled GSL I – isolectin B4 | Vector Labs | FL-1201 | |
| Glucose | Merk | 1083371000 | |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 24020-133 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 14170-138 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I5500 | |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | |
| L-Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| LN229 | Cell-Lines-Service | 300363 | |
| Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue) | B.Braun | 1050052 | |
| Millicell Culture Inserts | Millipore | PICMORG50 | |
| NMDA N-methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Normal Horse Seum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Petri dishes (all sizes) | Greiner | 627160/664160/628160 | |
| PFA | Roth | 0335.1 | toxic |
| Propidium iodid (PI) | Sigma Aldrich | 81845-25MG | toxic |
| U138 | ATCC | HTB-14 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT 1200 |
References
- Gähwiler, B. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20 (10), 471-477 (1997).
- Bahr, B. A. Long-Term Hippocampal Slices: A Model System for Investigating Synaptic Mechanisms and Pathologic Processes. J Neurosci Res. 42 (3), 294-305 (1995).
- Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. Imaging microglia in brain slices and slice cultures. Cold Spring Harbor Protoc. 2013 (12), 1142-1148 (2013).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Kleinberger-Doron, N., Schramm, M. Culture of mature hippocampus slices for 4 days in a newly developed medium: preservation of transmitter release and leucine incorporation into protein. Brain Res. 533 (2), 239-247 (1990).
- Legradi, A., Varszegi, S., Szigeti, C., Gulya, K. Adult rat hippocampal slices as in vitro models for neurodegeneration Studies on cell viability and apoptotic processes. Brain Res Bull. 84 (1), 39-44 (2011).
- Gähwiler, B. H. Organotypic Monolayer Cultures of Nervous Tissue. J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).
- Gähwiler, B. H. Organotypic cultures of neural tissue. Trends Neurosci. 11 (11), 484-489 (1988).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J Neurosci Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
- Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocamal slice culture from the adult mouse brain: A versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
- Xiang, Z., Hrabetova, S., et al. Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro. J Neurosci Methods. 98, 145-154 (2000).
- Adamchik, Y., Frantseva, M. V., Weisspapir, M., Carlen, P. L., Perez Velazquez, J. L. Methods to induce primary and secondary traumatic damage in organotypic hippocampal slice cultures. Brain rRes Brain Res Protoc. 5, 153-158 (2000).
- Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Curr Neuropharmacol. 5 (1), 19-33 (2007).
- Noraberg, J., Poulsen, F. R., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Curr Drug Targets CNS Neurol Disord. 4 (4), 435-452 (2005).
- De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. a Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550 (Pt 1), 135-147 (2003).
- Poindrom, P., Piguet, P., Förster, E. . New Methods for Culturing Cells from Nervous Tissues. , (2005).
- Berger, T., Frotscher, M. Distribution and morphological characteristics of oligodendrocytes in the rat hippocampus in situ and in vitro: An immunocytochemical study with the monoclonal Rip antibody. J Neurocytol. 23 (1), 61-74 (1994).
- Haber, M., Vautrin, S., Fry, E. J., Murai, K. K. Subtype-specific oligodendrocyte dynamics in organotypic culture. Glia. 57 (9), 1000-1013 (2009).
- Bonde, C., Sarup, A., Schousboe, A., Gegelashvili, G., Zimmer, J., Noraberg, J. Neurotoxic and neuroprotective effects of the glutamate transporter inhibitor DL-threo-beta-benzyloxyaspartate (DL-TBOA) during physiological and ischemia-like conditions. Neurochem Int. 43 (4-5), 371-380 (2003).
- Derouiche, A., Heimrich, B., Frotscher, M. Loss of layer-specific astrocytic glutamine synthetase immunoreactivity in slice cultures of hippocampus. Eur J Neurosci. 5 (2), 122-127 (1993).
- Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R. Resting microglial cells in vitro: analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 18 (4), 319-331 (1996).
- Hailer, N. P., Wirjatijasa, F., Roser, N., Hischebeth, G. T. R., Korf, H. W., Dehghani, F. Astrocytic factors protect neuronal integrity and reduce microglial activation in an in vitro model of N-methyl-D-aspartate-induced excitotoxic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Eur J Neurosci. 14 (2), 315-326 (2001).
- Bahr, B. A., Kessler, M., et al. Stable maintenance of glutamate receptors and other synaptic components in long-term hippocampal slices. Hippocampus. 5 (5), 425-439 (1995).
- Holopainen, I. E. Organotypic hippocampal slice cultures: A model system to study basic cellular and molecular mechanisms of neuronal cell death, neuroprotection, and synaptic plasticity. Neurochem Res. 30 (12), 1521-1528 (2005).
- Guy, Y., Rupert, A. E., Sandberg, M., Weber, S. G. A simple method for measuring organotypic tissue slice culture thickness. J Neurosci Methods. 199 (1), 78-81 (2011).
- Grabiec, U., Koch, M., et al. The endocannabinoid N-arachidonoyldopamine (NADA) exerts neuroprotective effects after excitotoxic neuronal damage via cannabinoid receptor 1 (CB 1). Neuropharmacology. 64 (4), 1797-1807 (2012).
- Daviaud, N., Garbayo, E., Schiller, P. C., Perez-Pinzon, M., Montero-Menei, C. N. Organotypic cultures as tools for optimizing central nervous system cell therapies. Exp Neurol. 248, 429-440 (2013).
- Ebrahimi, F., Hezel, M., Koch, M., Ghadban, C., Korf, H. W., Dehghani, F. Analyses of neuronal damage in excitotoxically lesioned organotypic hippocampal slice cultures. Ann Anat. 192 (4), 199-204 (2010).
- He, S., Shao, L. R., Wang, Y., Bausch, S. B. Synaptic and extrasynaptic plasticity in glutamatergic circuits involving dentate granule cells following chronic N-methyl-D-aspartate receptor inhibition. J Neurophysiol. 109 (6), 1535-1547 (2013).
- Kann, O., Taubenberger, N., et al. Muscarinic receptor activation determines the effects of store-operated Ca2+-entry on excitability and energy metabolism in pyramidal neurons. Cell Calcium. 51 (1), 40-50 (2012).
- Pérez-Gómez, A., Tasker, R. A. Enhanced neurogenesis in organotypic cultures of rat hippocampus after transient subfield-selective excitotoxic insult induced by domoic acid. Neurosciences. 208, 97-108 (2012).
- Raineteau, O., Rietschin, L., Gradwohl, G., Guillemot, F., Gähwiler, B. H. Neurogenesis in hippocampal slice cultures. Mol Cell Neurosc. 26 (2), 241-250 (2004).
- Pozzo Miller, L. D., Mahanty, N. K., Connor, J. A., Landist, D. M. D. Pyramidal Cell Death in Slice Cultures From Rat Hippocampus Is Prevented By Glutamate Receptor Antagonists. Neurosciences. 63 (2), (1994).
- Koch, M., Kreutz, S., et al. The cannabinoid WIN 55,212-2-mediated protection of dentate gyrus granule cells is driven by CB 1 receptors and modulated by TRPA1 and Ca v2.2 channels. Hippocampus. 21 (5), 554-564 (2011).
- Pukrop, T., Dehghani, F., et al. Microglia promote colonization of brain tissue by breast cancer cells in a Wnt-dependent way. Glia. 58 (12), 1477-1489 (2010).
- Kohl, A., Dehghani, F., Korf, H. W., Hailer, N. P. The bisphosphonate clodronate depletes microglial cells in excitotoxically injured organotypic hippocampal slice cultures. Exp Neurol. 181 (1), 1-11 (2003).
- Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model. Biochem Biophys Res Commun. 269 (2), 513-520 (2000).
- Aaberg-Jessen, C., Nørregaard, A., Christensen, K., Pedersen, C. B., Andersen, C., Kristensen, B. W. Invasion of primary glioma- and cell line-derived spheroids implanted into corticostriatal slice cultures. Int J Clin Exp Pathol. 6 (4), 546-560 (2013).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. J Vis Exp. (99), e52686 (2015).
- Hagemann, C., Fuchs, S., et al. Impact of MACC1 on human malignant glioma progression and patients ‘ unfavorable prognosis. Neuro Oncol. 15 (12), 1696-1709 (2013).
- Hohmann, T., Grabiec, U., Ghadban, C., Feese, K., Dehghani, F. The Influence of Biomechanical Properties and Cannabinoids on Tumor Invasion. Cell Adh Migr. 11 (1), 54-67 (2016).
